3D打印n-HA/殼聚糖/米諾環素復合支架的構建與其理化性能、細胞毒性研究

牛婉瓊, 楊 楠, 劉佳怡, 汪振華

(1石河子大學醫學院, 新疆 石河子 832000; 2烏魯木齊市口腔醫院修復科, 烏魯木齊 830002)

種植牙技術是目前臨床上治療牙體、牙列缺失的常用手段,具有修復美觀、功能改善效果好等優點,但術后部分患者種植體周圍因各種原因發生炎癥感染,導致種植體周圍骨丟失,植體發生松動、脫落,嚴重影響遠期預后[1]。研究種植體周圍炎(PI)以及如何控制、治療種植體周圍炎骨缺損是口腔醫師急需解決的問題[2]。研究發現局部給藥米諾環素微球聯合其他藥物或者方法清創對種植體周圍炎有效[3]。

納米羥基磷灰石作為骨替代材料已在骨增量和種植體涂層方面廣泛應用,參與復合構建新骨成型的支架,但納米羥基磷灰石(Nano-hydroxyapatite,n-HA)存在脆性較大、強度較低、生物降解速度慢等缺點[4],經常被用來與可降解的天然高分子材料組合來改善其缺點,殼聚糖(Chitosan,CS)是其選擇之一。殼聚糖是甲殼素的脫乙酰產物,天然材料,具有無細胞毒性、可降解性、抗菌能力和止血作用的特性[5],還具有載藥功能,發揮藥物的緩釋、控釋作用[6]。

臨床中,數字化制造技術可以幫助臨床口腔醫生為牙列缺失和缺損的患者更快、更好地提供新種植體和骨缺損材料[7]。3D打印技術的應用可以節約骨充填材料并減少手術過程中的創傷,達到精準、微創、快速修復的要求,同時還能縮短治療周期[8]。基于以上背景,本研究通過3D打印技術構建n-HA/CS復合支架,探究不同復合支架的理化性質及細胞毒性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器納米羥基磷灰石(上海阿拉丁試劑有限公司,規格:97%,粒徑<100 nm),殼聚糖(上海阿拉丁試劑有限公司,規格:25 g),米諾環素(天津阿拉丁試劑有限公司),氫氧化鈉、無水乙醇、乙酸(新疆農業大學提供),打印成型機(新疆大學自建),小鼠成纖維細胞L-929(山東國際生物科技園提供),培養瓶、離心管、96孔細胞培養板(蘇州柯仕達電子材料有限公司),四唑鹽(MTT)、磷酸緩沖液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO)、RPMI1640細胞培養液,胎牛血清,胰蛋白酶,生理鹽水溶液(北京索萊寶科技有限公司)。生物安全柜、低溫高速離心機、CO2培養箱(美國Thermo Scientific),全自動酶標儀(美國BioTek),臺式低速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司),光學顯微鏡(日本Olympus 1×71),電子萬能試驗機(三思縱橫UTM6000系列),掃描電鏡(日本電子JSM-7610F系列),電子天平(瑞士Precisa)。

1.2 實驗方法及分組3D打印n-HA/殼聚糖/米諾環素復合支架模型是取1 g殼聚糖(脫乙酰度為85%～90%)粉末,溶解于6 mL濃度為0.2 mol/L的乙酸,在50℃條件下均勻攪拌1 h,此時的溶液為殼聚糖溶液(質量濃度為1%),之后再分批次分別加入2.5、3.5、4.5 g的納米羥基磷灰石,相同條件下繼續攪拌2 h,形成羥基磷灰石/殼聚糖溶液,再分別將1、5、10 μmol/L的米諾環素粉末溶于1 mL無水乙醇,將以上兩溶液混合后,繼續攪拌20 min,形成米諾環素/CS/n-HA溶液。由于加入不同質量的羥基磷灰石和不同濃度的米諾環素,經組合,實驗組分為S1(n-HA 2.5 g、米諾環素1 μmol/L)、S2(n-HA 3.5 g、米諾環素1 μmol/L)和S3(n-HA 4.5 g、米諾環素1 μmol/L);S4(n-HA 2.5 g、米諾環素5 μmol/L)、S5(n-HA 3.5 g、米諾環素5 μmol/L)和S6(n-HA 4.5 g、米諾環素5 μmol/L);S7(n-HA 2.5 g、米諾環素10 μmol/L)、S8(n-HA 3.5 g、米諾環素10 μmol/L)和S9(n-HA 4.5 g、米諾環素10 μmol/L)。對照組分為D1(n-HA 2.5 g、米諾環素0 μmol/L)、D2(n-HA 3.5 g、米諾環素0 μmol/L)和D3(n-HA 4.5 g、米諾環素0 μmol/L)。將各組溶液裝入3D打印成型機中,設置長方體編程程序(噴印邊長10 mm,高3 mm),啟動設置,開始打印支架。待支架打印成形后,浸泡在5%的氫氧化鈉溶液中30 min,將乙酸徹底去除,之后材料用蒸餾水沖洗至中性,室溫下干燥24 h。

1.3 各組支架理化性質檢測

1.3.1 吸水率檢測 對復合支架進行吸水試驗,評定其親水性。稱得各組支架干燥時的質量M0,37℃下放入裝有50 mL蒸餾水(pH=7.4的0.01 mol/L PBS中)的燒杯中,每隔0.5、1、4、8、24、36、48 h取各組的樣本,檢測樣本支架質量,濾紙吸除支架表面多余水分后稱得質量M1,計算支架吸水率。吸水率=(M1-M0)/M0×100%。

1.3.2 力學性能檢測 支架拉伸試驗:將支架裁取成10 mm×1.5 mm的樣條,常溫下用電子萬能試驗機對支架進行拉伸測試,以0.5 mm/min的速率進行測試。

1.3.3 孔徑檢測 每組取3個樣品,掃描電鏡下觀察支架內部結構、孔隙連通性,測量孔徑大小取其平均值并記錄。

1.3.4 支架表面形貌觀察 利用原子力顯微鏡觀察各組支架的表面粗糙度,然后在支架表面噴金,再用掃描電子顯微鏡觀察材料的表面微觀結構。

1.3.5 pH值的測定 (1)紫外線30 min照射細胞無菌操作室;(2)照射完畢后,進入操作室內進行實驗;(3)將250 mg支架材料加入1 mL培養基中,并放置在37℃恒溫培養箱中培養;(4)1～10 d取同一時間的浸出液,同時放入冰箱4℃保存;(5)每次取樣結束后,用檢測儀對浸出液的pH值進行精確檢測;(6)每組樣品重復實驗3次,統計實驗結果并取均值。

1.3.6 支架體外降解性能分析 選擇生理鹽水溶液作為材料的降解介質,研究材料的體外降解行為。取樣品10份,每份干燥稱質量,將其浸沒于質量為自身質量100倍的生理鹽水中,空氣環境中在37℃電熱恒溫培養箱下進行培養,連續10周,分別于每周同一時間隨機取出1份,稱取質量,分析降解性能。降解率=(M0-M1)/M0×100%,M0為支架材料的原始質量,M1為支架材料降解后的質量。

1.4 復合支架MTT細胞毒性檢測取對數生長期小鼠成纖維細胞(L-929)并配置成單細胞懸液,在3塊96孔板中,分別將細胞以3×104個/mL,且每孔接種100 μL的質量接種后,放置于CO2培養箱(含體積分數5%二氧化碳氣體)中,37℃條件下培養24 h,廢棄原培養液。之后分別添加各組復合支架浸出液200 μL,繼續放置在5%CO2、37℃的培養箱中,同時以不加浸提液的小鼠細胞為空白對照組。72 h后,再在每孔中加入質量濃度為5 g/L的MTT溶液100 μL,再于4 h后去除孔板中溶液,加DMS0液體600 μL,置于振蕩器振蕩10 min,在酶標儀560 nm波長下測定各組的吸光度(OD值)。在1、3、5、7、9、11 d的同一時間點各取一塊板,記錄OD值,倒置顯微鏡觀察細胞生長情況及其形態。細胞毒性分級如下:相對增殖率(RGR)≥100%為0級;99%≥相對增殖率≥80%為1級;79%≥相對增殖率≥50%為2級;49%≥相對增殖率≥30%為3級;29%≥相對增殖率≥0%為4級。

2 結果

2.1 復合支架的表面形態打印出的復合支架為約10 mm×10 mm×3 mm的長方體,呈乳白色,肉眼可見支架縱橫結構內存在多孔隙,表面粗糙,有一定的韌性和脆性,見圖1。

圖1 復合支架表面形態

2.2 各組復合支架的理化性質

2.2.1 各組支架吸水率變化 對照組D1-D3中,隨著n-HA質量的增加,吸水率呈逐漸下降趨勢,但D1、D2、D3組間差異無統計學意義(P=0.896)。各實驗組吸水率在4 h左右趨于穩定,相同n-HA質量下實驗組(即S1、S4和S7;S2、S5和S8;S3、S6和S9)的吸水率隨著米諾環素濃度的增高緩慢增加(P=0.000 9),其中S7組在4 h時的吸水率最高,為213.5%,但隨著時間的延長,各實驗組吸水率又慢慢降低,S7、S8、S9組在24～36 h時降低速度最快,可能由于米諾環素自身具有親水性的特性,可以在2～4 h內溶于水中,見圖2。

圖2 對照組D1-D3和實驗組S1-S9的吸水率變化情況

2.2.2 各組支架力學性能比較 隨著n-HA質量的增加,對照組D1-D3復合支架的拉伸強度和最大載荷均有不同程度的降低(P=0.000 2)。實驗組S1-S6復合支架的拉伸強度隨著米諾環素濃度的增加而增大,當米諾環素的濃度繼續增加至10 μmol/L后,S7、S8、S9組拉伸強度反而降低,實驗組S9的拉伸強度僅為1.47 MPa,見表1。

表1 各組支架力學性能比較

2.2.3 各組孔徑大小比較 研究表明,促進骨組織修復再生的孔隙率應至少在50%以上[9],本研究中各組支架的孔隙率均符合這一要求,且孔徑越大支架孔隙率越高,見表2。

表2 各組孔徑大小比較

2.2.4 各組支架表面形貌情況 電鏡下復合支架呈網狀結構,材料間相互結合,有大小不等的孔隙,分布不均勻。電鏡下放大1 000倍后,隨著n-HA質量的增加,D1、D2、D3對照組的孔隙在逐漸減小。同時隨著米諾環素濃度的增加,相同n-HA質量下各實驗組的支架孔隙也在逐漸減小,支架表面具有貫通的空隙,見圖3。

圖3 電鏡下各組支架的表面形貌(×1 000)

2.2.5 各組支架pH值的比較 隨著n-HA質量的增加,pH值變化不大,未見明顯升高或降低(P=0.000 6),隨著米諾環素濃度的增加,相同n-HA質量下的實驗組pH值降低(P=0.003)。實驗組S1-S9的pH值于7～8 d的時間點時趨于相對穩定狀態,其中S8組的復合支架的pH值(6.8～7.2)在趨于穩定時更接近健康牙周組織的pH值[10],見圖4。

圖4 各組支架1～10 d的pH值變化情況

2.2.6 各組支架體外降解性能比較 經過連續10周的降解,顯示支架具有一定的生物穩定性,同時隨時間推移緩慢降解;隨著米諾環素濃度的增加,降解率降低,隨著n-HA質量的增加,降解率增加,見圖5。

圖5 各組支架第10周降解率比較

2.3 復合支架MTT細胞毒性檢測小鼠L-929細胞培養的第1天,各實驗組間細胞OD值比較差異無統計學意義;培養第3天,S1-S6組復合支架細胞的OD值與對照組比較差異無統計學意義(P=0.65),此時10 μmol/L米諾環素復合支架組(即S7、S8、S9)的OD值到達峰值,隨著時間增加OD值在不斷降低,抑制了細胞增殖(P=0.007),說明具有一定的細胞毒性。而1 μmol/L、5 μmol/L米諾環素復合支架組(即S1-S6)的OD值在第5天左右達到最高水平,后期則基本保持不變,見圖6。

圖6 不同濃度米諾環素支架處理后的小鼠L929細胞11 d內增殖情況

S1-S6組的細胞相對增殖率(RGR)均在80%以上,毒性分級為0～1級,細胞毒性評價均合格。S7、S8、S9組RGR的分級中出現了2、3級,其余各組之間細胞增殖率差異無統計學意義,見表3。

表3 各組支架培養小鼠L-929細胞相對增殖率與細胞毒性分級評價

在1～11 d內顯微鏡下觀察細胞形態發現,各組復合支架材料浸提液中的小鼠L-929細胞貼壁生長、增殖情況非常好,第3天時鏡下觀察細胞數量的差異不大,此后細胞逐漸貼壁生長,多數呈卵圓形或者是梭形,細胞數量開始增多,見圖7。

圖7 各組支架浸提液中的小鼠L-929細胞形態(×400)

3 討論

隨著骨組織工程的發展,支架作為細胞的載體,主要為細胞提供營養和代謝的化學環境和物理支撐;利用支架材料修復骨組織損傷的過程中,支架是決定缺損部位組織結構能否實現重建、恢復組織再生能力的關鍵性因素,同時也為細胞的黏附、生長、增殖、遷移、分化等生物學功能提供有利場所[11-12]。支架的組成材料及復合方式決定了支架的內部結構,同樣也決定著其物理性質和機械性能。本實驗通過3D打印技術完成羥基磷灰石、殼聚糖、米諾環素材料的結合,成功構建了復合載藥支架。

對復合支架試驗研究中發現,3D打印不同質量n-HA/CS/米諾環素復合支架具有良好的物理、化學、細胞毒性低的性能,力學檢測中隨著n-HA質量的增加,對照組支架的拉伸強度和最大載荷均有不同程度的降低,實驗組S1-S6復合支架拉伸強度隨米諾環素增加而增大,當米諾環素的濃度持續加至10 μmol/L后,S7、S8、S9組拉伸強度反而降低;隨著n-HA質量的增加,吸水率呈逐漸下降趨勢,同一n-HA質量下實驗組的吸水率隨著米諾環素濃度的增高緩慢增加,但隨著時間的延長,各實驗組吸水率又慢慢降低;相同n-HA質量下的實驗組pH值隨米諾環素濃度的增加在降低;隨著米諾環素濃度的增加,降解率降低,隨著n-HA質量的增加,降解率反而增加;MTT細胞毒性檢測中,低濃度米諾環素實驗組與對照組差異不大,當米諾環素濃度為10 μmol/L時,實驗組OD值在3 d后出現抑制細胞增殖的情況,有細胞毒性。

有研究表明,米諾環素、殼聚糖、納米羥基磷灰石的降解速率依次降低,隨著米諾環素、殼聚糖比例的增加,支架材料的降解率變快,可能由于這兩種材料有較好的親水能力[13-14]。因此控制好米諾環素、殼聚糖、納米羥基磷灰石的質量比例,使得降解速度與成骨速率相當,這樣才能有效地修復骨缺損,從而做到在支架材料降解的同時有新骨進入生長。

本實驗中MTT浸提比例的問題還有待研究,馬鳳森等[15]的研究認為可降解材料在體內的降解與吸收是一個動態平衡過程,研究其浸提比例應該引起人們的重視。本實驗未能詳細研究浸提液比例的分組實驗,在后期會進一步完善。

本次構建的支架還需進行后續的動物實驗來進行種植體周圍炎的骨缺損的修復,觀察支架能否進行3D個性化打印并幫助支持骨恢復原有狀態[16]。米諾環素不僅能夠抑制種植體周圍炎的致病菌,還能夠促進牙周膜細胞的增殖[17-18],所以動物實驗時會著重觀察支架的植入是否會抑制植體周圍的致病菌和能否促進成植體周圍的成骨細胞生長、增殖[19]。在本課題組的后續實驗中將精進實驗進一步提供有用的實驗數據。

綜上,3D打印的n-HA/CS/米諾環素復合支架有較好的物理性能及親水性,未來可能會成為治療口腔種植體周圍炎骨缺損的一種性能更為優良的修復材料,但該復合支架對種植體周圍炎的相關性能表現及臨床應用仍需做進一步的探討和實驗。