IL-9、IL-17及TGF-β1在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肝泡狀棘球蚴病中的表達(dá)及臨床意義

楚 慧, 馬 倩, 劉 婷, 桑 偉

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科, 烏魯木齊 830054)

泡狀棘球蚴病(Alreolar echinococcosis,AE)是由多房棘球蚴絳蟲的幼蟲寄生引起的一種致死性人獸共患寄生蟲病,肝臟是多房棘球蚴感染的主要寄生器官。2005-2016年全國(guó)幾乎所有的省(直轄市、自治區(qū))均有棘球蚴病的病例報(bào)告[1]。新疆地區(qū)患病率達(dá)5%～10%,10年病死率高達(dá)95%,近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。泡狀棘球蚴病的醫(yī)治方式主要是手術(shù)治療及長(zhǎng)期服藥,治療后患者需要定期隨診,一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,如不及時(shí)治療,5年存活率僅為56%,而經(jīng)化學(xué)藥物治療后存活率可以提升到96%[2]。有研究顯示泡狀棘球蚴病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與免疫逃逸相關(guān)[3-4]。白細(xì)胞介素-9(Interleukin-9,IL-9)、白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)免疫應(yīng)答在棘球蚴促進(jìn)免疫逃避過程中發(fā)揮重要的作用[5-8],但大部分實(shí)驗(yàn)基于動(dòng)物模型及人血清中相關(guān)因子的研究,尚未在人體感染泡狀棘球蚴病的組織以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的病例中進(jìn)一步證實(shí)。本研究通過制作組織微陣列(Tissue microarray, TMA),應(yīng)用免疫組化(IHC)方法檢測(cè)人肝泡狀棘球蚴病灶旁炎癥細(xì)胞IL-9、IL-17及TGF-β1的表達(dá)以及與臨床病理特征的關(guān)系,初步從組織水平觀察3種蛋白表達(dá)水平與肝泡狀棘球蚴病的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性,為患者術(shù)后評(píng)估疾病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和進(jìn)一步診治提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2002年11月-2019年11月人感染泡狀棘球蚴病肝部分切除術(shù)后61例未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和32例肝臟復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移至其他臟器的病例,均選取初次手術(shù)切除標(biāo)本。所有標(biāo)本切片由2位高年資病理醫(yī)師復(fù)核證實(shí),并選取有代表性病變的石蠟包埋蠟塊備用,所有病例臨床資料完整。通過電話、門診檢查和住院隨訪等3種方式來實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)收集患者近期臨床和生存健康質(zhì)量信息,以患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)間為終點(diǎn)事件,隨訪記錄信息至2022年11月30日。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法所取標(biāo)本均包含肝泡狀棘球蚴病灶及病灶旁,經(jīng)3.7%中性甲醛固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,3 μm厚切片,HE染色,光鏡觀察,選取肝泡狀棘球蚴病灶旁炎癥細(xì)胞制作TMA,行IHC法檢測(cè)炎癥細(xì)胞中IL-9、IL-17和TGF-β1的蛋白表達(dá)情況。

1.3 主要試劑及設(shè)備試劑均購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司:小鼠單克隆IL-9抗體(貨號(hào):66144-1-Ig,稀釋比1∶50);兔多克隆IL-17抗體(貨號(hào):13082-1-AP,稀釋比1∶200);小鼠單克隆TGF-β1抗體(貨號(hào):13111-1-AP,稀釋比1∶200);PBS、EDTA抗原修復(fù)液、通用型二抗(均購(gòu)于中國(guó)中杉金橋);采用Dako全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色系統(tǒng),操作步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定定位判讀:評(píng)估目標(biāo)均為病灶旁的炎癥細(xì)胞。IL-9陽(yáng)性定位于細(xì)胞胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜;IL-17陽(yáng)性定位于細(xì)胞胞質(zhì);TGF-β1陽(yáng)性定位于細(xì)胞胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜。所有陽(yáng)性表達(dá)均為棕黃色。判讀標(biāo)準(zhǔn):運(yùn)用Aipathwell軟件[9-10]選擇棕黃色作為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)判斷所有圖片的陽(yáng)性區(qū)域,通過分析每張圖片得到組織的累計(jì)光密度值(IOD)和像素面積(AREA),得出平均光密度值[11-12],平均光密度值(AO值)= IOD/AREA。AO值越高,陽(yáng)性表達(dá)越高。每個(gè)病例圖片隨機(jī)選取3個(gè)部位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并取平均值。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料93例肝泡狀棘球蚴病患者中女性47例(50.54%),男性46例(49.46%),中位年齡37歲(28～48歲)。截至2022年11月30日,術(shù)后有32例(34.41%)患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,其中P1有0例,P2有6例(18.74%),P3有13例(40.63%),P4有13例(40.63%);N0有13例(40.63%),N1有19例(59.37%);M0有12例(37.50%),M1有20例(62.50%)。61例(65.59%)患者未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,其中P1有14例(22.95%),P2有29例(47.54%),P3有13例(21.31%),P4有5例(8.20%);N0有46例(75.41%),N1有15例(24.59%);M0有55例(90.16%),M1有6例(9.84%)。PNM分期參照世界衛(wèi)生組織包蟲病專家組(WHO/IWGE)標(biāo)準(zhǔn)[13]:P0肝臟無可見病灶,P1周圍病灶、無血管和膽道累計(jì),P2中央病灶、局限在半肝內(nèi)、有血管及膽道累及,P3中央病灶侵及左右肝臟、并有肝門部血管和膽道累及,P4肝臟病灶伴有肝血管和膽道樹的擴(kuò)張;N0無鄰近器官、組織累及,N1有鄰近器官、組織累及;M0無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,M1單個(gè)病灶遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

2.2 IL-9、IL-17、TGF-β1在肝泡狀棘球蚴病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)情況IL-9和IL-17在術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肝泡狀棘球蚴病灶旁炎癥細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈彌漫陽(yáng)性表達(dá),其表達(dá)水平均高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組織,二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),TGF-β1在術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肝泡狀棘球蚴病灶旁炎癥細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈局灶弱陽(yáng)性表達(dá),二者間表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1、圖1。

注:①肝泡狀棘球蚴病灶及周圍炎癥細(xì)胞 (HE 4×)→炎癥反應(yīng)帶;②棘球蚴育囊及原頭蚴 (HE 40×)→育囊及原頭蚴;③IL-9在未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肝泡狀棘球蚴病灶旁炎癥細(xì)胞中的表達(dá) (IHC 20×);④IL-9在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肝泡狀棘球蚴病灶旁炎癥細(xì)胞中的表達(dá) (IHC 20×);⑤IL-17在未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肝泡狀棘球蚴病灶旁炎癥細(xì)胞中的表達(dá) (IHC 20×);⑥IL-17在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肝泡狀棘球蚴病灶旁炎癥細(xì)胞中的表達(dá) (IHC 20×);⑦TGF-β1在未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肝泡狀棘球蚴病灶旁炎癥細(xì)胞中的表達(dá) (IHC 20×);⑧TGF-β1在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肝泡狀棘球蚴病灶旁炎癥細(xì)胞中的表達(dá) (IHC 20×)。

表1 IL-9、IL-17、TGF-β1在人肝泡狀棘球蚴病組織中表達(dá)差異分析

2.3 IL-9、IL-17在肝泡狀棘球蚴病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的相關(guān)性分析IL-9與IL-17的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.377,P<0.001),見圖2。

2.4 肝泡狀棘球蚴病患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的單因素分析職業(yè)、年齡、婚姻狀況、IL-9表達(dá)水平在肝泡狀棘球蚴病患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),性別和IL-17表達(dá)水平在肝泡狀棘球蚴病患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 肝泡狀棘球蚴病患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素/例(%)

2.5多因素Cox回歸分析以肝泡狀棘球蚴病患者預(yù)后情況為因變量(1=復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,2=未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移),以單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量為自變量,進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示,職業(yè)是肝泡狀棘球蚴病患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素,農(nóng)牧民患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率是非農(nóng)牧民患者的2.438倍(P=0.020),見表3、4。

表3 Cox回歸變量賦值情況

表4 肝泡狀棘球蚴病患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

泡狀棘球蚴病能在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活并利用宿主體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行增殖和轉(zhuǎn)移,與其有著多種復(fù)雜的免疫逃避機(jī)制有關(guān)[3-4]。在感染棘球蚴后,包蟲本身和其代謝產(chǎn)物可引起宿主體內(nèi)細(xì)胞免疫和體液免疫的一系列改變。此過程中,通過改變宿主細(xì)胞因子產(chǎn)生的數(shù)量和/或種類來逃避宿主的免疫殺傷作用,從而可長(zhǎng)期寄生于宿主體內(nèi)[14]。逃避宿主免疫效應(yīng)是寄生蟲維持寄生的關(guān)鍵因素。在寄生蟲與宿主長(zhǎng)期相互適應(yīng)過程中,通過多種途徑逃逸宿主免疫效應(yīng)的攻擊。其中,CD4+T細(xì)胞在哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[15-16]。CD4+T細(xì)胞可分化為不同亞型的輔助T細(xì)胞對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)和宿主防御,包括Th1、Th2、Th9、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等。Th17、Th9分別分泌IL-17、IL-9免疫調(diào)節(jié)因子[17],TGF-β主要是由Treg細(xì)胞分泌[18],以上細(xì)胞不僅具有控制自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化和增殖的作用,而且對(duì)不同免疫抑制功能亦發(fā)揮著重要的作用[15-16]。

龐楠楠等[19]的研究發(fā)現(xiàn),在肝囊型包蟲病患者外周血中Th9細(xì)胞的數(shù)量和IL-9表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組,提示Th9細(xì)胞以及其分泌產(chǎn)物IL-9在肝囊型包蟲病患者的慢性感染中可能起著重要作用。Heim等[20]在非小細(xì)胞肺癌小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃腕w外實(shí)驗(yàn)中顯示,IL-9通過與腫瘤細(xì)胞IL-9R結(jié)合促進(jìn)腫瘤增殖,以及通過IL-9/IL-10信號(hào)通路影響Foxp3+T細(xì)胞浸潤(rùn)來驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸,而抗IL-9免疫療法可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示,IL-9在人感染泡狀棘球蚴病患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)水平高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組織,推測(cè)IL-9可能參與宿主免疫逃逸,有利于泡球蚴的快速增殖以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

IL-17是一種促炎癥細(xì)胞因子,是溝通固有免疫與適應(yīng)免疫功能的橋梁[21]。Chen等[22]使用C57BL/6小鼠的日本血吸蟲幼蟲感染模型,通過RT-qPCR和ELISA分析感染肝臟中IL-17的動(dòng)態(tài)表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,感染小鼠的肝淋巴細(xì)胞中IL-17的表達(dá)明顯上調(diào),提示IL-17參與了宿主的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)。Pang等[23]測(cè)量小鼠AE模型感染后Th17細(xì)胞的百分比和IL-17的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞的百分比增加、IL-17表達(dá)水平升高,認(rèn)為IL-17可能參與調(diào)節(jié)免疫耐受和組織炎癥,并促進(jìn)多房棘球蚴在宿主中的長(zhǎng)期存活。本研究結(jié)果顯示IL-17在人感染泡狀棘球蚴病患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組織,提示IL-17可能參與泡狀棘球蚴復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,但具體調(diào)節(jié)機(jī)制還需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

TGF-β1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)控制和抑制免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)功能。王俊華等[24]研究發(fā)現(xiàn),泡型包蟲患者和泡球蚴感染小鼠病灶周圍肉芽腫附近TGF-β1表達(dá)上調(diào),抑制免疫細(xì)胞的活性,使機(jī)體形成免疫抑制狀態(tài),推測(cè)泡球蚴通過誘導(dǎo)宿主免疫細(xì)胞的凋亡造成免疫逃避而達(dá)到寄生的目的。Huang等[25]在體外和體內(nèi)研究了TGF-β1在肝細(xì)胞癌中的遷移和侵襲作用,顯示TGF-β1通過ERK途徑介導(dǎo)的FGFR4表達(dá),促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究檢測(cè)了TGF-β1在人感染泡狀棘球蚴患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組織樣本中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)TGF-β1在兩者間無明顯差異,提示TGF-β1在預(yù)測(cè)肝泡狀棘球蚴病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中可能不具有臨床提示意義。

有研究顯示IL-9對(duì)IL-17的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用,在TGF-β存在的條件下,IL-9能使幼稚CD4+T細(xì)胞分化成Th17細(xì)胞[26-27]。此外,研究發(fā)現(xiàn)IL-9能利用γc受體使Th17細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)一步增加,IL-9與IFN-α相互協(xié)作促進(jìn)原始CD4+T細(xì)胞分化成Th17細(xì)胞,從而導(dǎo)致IL-17水平增加[28-30]。以上研究表明,IL-9促進(jìn)IL-17的表達(dá),共同調(diào)節(jié)機(jī)體免疫過程。本研究結(jié)果顯示IL-9和IL-17在肝泡狀棘球蚴病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的組織樣本中的表達(dá)呈正相關(guān),但兩者的關(guān)系需在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究和明確。