紅豆杉對糖尿病腎病模型大鼠PI3K/Akt信號通路的干預作用

熊艷文, 蔡 振, 丁 陽, 周圓圓

(上海市利群醫院1中醫科, 2泌尿外科, 上海 200333)

糖尿病腎病是糖尿病主要的微血管并發癥之一,是多基因參與的復雜疾病[1],也是導致終末期腎病和患者死亡的主要原因,其早期診斷依據是腎小管損傷和足細胞,而腎小球的高濾過是引起近端小管功能障礙的主要影響因素之一[2]。有研究表明,腎小管中的補體C3的激活,可介導免疫級聯效應,導致腎臟炎癥及腎部纖維化的病理改變[3]。說明免疫介導在糖尿病腎病中也發揮著重要作用。在發達國家,有20%以上的糖尿病患者在10年后會發展為糖尿病腎病,50%以上的糖尿病患者在20年后會發展為糖尿病腎病[4],若病情未能有效控制,會發展為終末期腎病。在我國,約有5%的糖尿病腎病患者進展為終末期腎病[5],嚴重影響患者的生活質量。因此,探討糖尿病腎病的發展機制,尋找有效的治療手段具有重要意義。紅豆杉味甘、微苦,性平,入肺、胃、大腸經,具有解毒散積、活絡止痛、利水消腫的功效[6],具有降血糖、抗氧化和抗應變性等藥理作用[7]。有研究報道,紅豆杉具有抑制肝糖原分解和葡萄糖吸收、降低血脂、改善自由基代謝和保護胰島β細胞的作用[8]。PI3K/Akt作為一條經典的信號通路,具有調節糖原合成、糖代謝、細胞增殖、細胞死亡、蛋白合成等功能[9]。相關研究報道,PI3K/Akt信號通路參與糖尿病腎病的發展[10]。因此本研究旨在觀察紅豆杉對糖尿病腎病模型大鼠相關指標、腎臟的作用及對PI3K/Akt信號通路的影響,為紅豆杉治療糖尿病腎病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性SD大鼠100只,體重180～210 g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司[許可證號:SCXK(滬)2022-0004]。動物飼養于恒溫22℃～24℃,燈光晝夜交替照明(12 h/12 h),5只為一籠,保證適宜活動空間,自由飲用純凈水和進食普通標準飼料,適應性飼養2周。

1.2 試劑與儀器紅豆杉(重慶賽諾生物藥業股份有限公司);厄貝沙坦分散片(濰坊中獅制藥有限公司);PI3K/Akt信號通路靶向抑制劑LY294002、鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司);BCA蛋白質定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);血管細胞黏附分子- 1(VCAM- 1)、纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1) (美國Proteintech Group公司);磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)一抗、羊抗鼠IgG二抗(美國Cell Signaling Technology公司);血糖和胰島素放免試劑盒(南京建成公司);RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3 動物建模與分組100只SD大鼠中隨機選取20只作為對照組(行腹腔手術但不摘除右腎,注射60 mg/kg體重生理鹽水);剩余80只SD大鼠適應性喂養1周后,水合氯醛腹腔注射麻醉,摘除右腎,1周后,腹腔注射60 mg/kg體重鏈脲佐菌素(STZ),誘導高血糖癥。72 h后,測定大鼠的空腹血糖(FPG),若空腹血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功。80只大鼠均造模成功,隨機分為模型組、厄貝沙坦組、紅豆杉組、紅豆杉+LY294002組,各20只。給藥方法:(1)對照組給予10 mL/kg體重的生理鹽水灌胃;(2)模型組給予10 mL/kg體重的生理鹽水灌胃;(3)厄貝沙坦組給予17.5 mg/kg體重的厄貝沙坦灌胃;(4)紅豆杉組給予3.26 mg/kg體重的紅豆杉水煎劑灌胃;(5)紅豆杉+LY294002組給予3.26 mg/kg的紅豆杉水煎劑灌胃的同時腹腔注射2.0 ng·mL-1·kg-1體重的LY294002,連續給藥8周。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠各項指標檢測 藥物干預8周后,收集尿液,3 500 r/min離心10 min,取上清,全自動生化儀測定各組大鼠24 h尿蛋白(24 hUTP)。10%水合氯醛腹腔注射麻醉,剖開腹腔,迅速抽取腹主動脈血,3 000 r/min離心10 min,取上清,采用血糖儀檢測空腹血糖(FPG);ELISA 試劑盒檢測空腹胰島素(INS)水平;全自動生化分析儀檢測膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、血肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)水平。

1.4.2 腎臟炎癥損傷相關蛋白、PI3K/Akt信號通路相關蛋白檢測 取約30 mg大鼠腎臟組織,研缽研碎,RIPA裂解液裂解,提取腎組織蛋白,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,凝膠電泳分離總蛋白,轉移至膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。應用VCAM-1(1∶500稀釋)、PAI-1(1∶500稀釋)、p-PI3K(1∶1 000稀釋)、PI3K(1∶1 000稀釋)、p-AKT(1∶1 000稀釋)、AKT(1∶1 000稀釋)、p-mTOR(1∶1 000稀釋)、mTOR(1∶1 000稀釋)一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1∶200稀釋)二抗,室溫孵育1 h,TBST洗膜,增強化學發光法(ECL)顯色、暗室內曝光及圖像分析。

1.4.3 臟器指數測定 每組取10只大鼠,迅速取雙腎,分離膜組織,生理鹽水清洗后吸干,稱重記錄腎臟重量,計算臟器指數。臟器指數=臟器重量(mg)/體重(g)×100%。

1.4.4 蘇木素-伊紅(HE)染色 每組取10只大鼠的腎臟組織,10%福爾馬林固定,乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片3 μm。蘇木精染色15 min,自來水返藍,伊紅染色2 min,酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,光鏡觀察大鼠腎臟病理學改變情況。

1.4.5 Masson染色 取大鼠腎臟組織,10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切片3 μm,常規二甲苯脫蠟,系列酒精水化,蘇木精染色1 min,沖洗液沖洗,麗春紅酸性品紅液染色30 s,沖洗液清洗,磷鉬酸分色6 min,亮綠藍染色5 min,2%冰醋酸2 min,乙醇脫水,二甲苯透明,樹脂固定,光鏡下觀察大鼠腎臟纖維化程度。

2 結果

2.1 各組大鼠相關指標的比較與對照組比較,模型組FPG、24 hUTP、TC、TG、LDL、Scr和BUN水平明顯升高,INS水平降低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,厄貝沙坦組、紅豆杉組、紅豆杉+LY294002組FPG、24 hUTP、TC、TG、LDL、Scr和BUN水平明顯降低,INS水平升高,差異有統計學意義(P<0.05),其中紅豆杉+LY294002組以上指標變化最明顯,見表1。

表1 各組大鼠各項指標比較

2.2 各組大鼠腎臟炎癥損傷相關蛋白表達比較與對照組比較,模型組VCAM-1和PAI-1蛋白表達明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,厄貝沙坦組、紅豆杉組、紅豆杉+LY294002組VCAM-1和PAI-1蛋白表達明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),其中紅豆杉+LY294002組中VCAM-1和PAI-1蛋白表達降低最明顯(P<0.05),見表2、圖1。

圖1 各組大鼠腎臟炎癥損傷相關蛋白表達

表2 各組大鼠腎臟炎癥損傷相關蛋白表達比較

2.3 各組大鼠臟器指數和腎臟病理學改變與對照組臟器指數(6.25±0.37)比較,模型組大鼠臟器指數(15.21±3.46)明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組臟器指數比較,厄貝沙坦組(12.53±1.81)、紅豆杉組(11.62±1.76)、紅豆杉+LY294002組(9.03±1.12)大鼠臟器指數明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),其中紅豆杉+LY294002組大鼠臟器指數降低最為明顯。HE染色結果顯示,對照組大鼠的腎小球和腎小管未見異常;模型組大鼠腎臟的病理組織結構紊亂,出現病理性損傷,腎小管間質水腫,腎小球系膜基質和系膜細胞中度增生,腎小體腫大,炎癥因子浸潤;經厄貝沙坦和紅豆杉干預后,與模型組比較,厄貝沙坦組、紅豆杉組、紅豆杉+LY294002組大鼠的腎間質和腎小管病理明顯改善,腎小體腫脹明顯減輕;其中紅豆杉+LY294002組大鼠的腎間質和腎小管病理改善最為明顯,腎小體腫脹減輕最明顯,見圖2。

2.4 各組大鼠腎臟膠原纖維的組織學變化Masson染色結果顯示,對照組大鼠腎臟組織中未觀察到藍色膠原纖維;模型組大鼠腎小球和腎小管間質中出現高密度的藍色膠原纖維;經厄貝沙坦和紅豆杉干預后,與模型組比較,厄貝沙坦組、紅豆杉組、紅豆杉+LY294002組大鼠的腎小球和腎小管間質中藍色膠原纖維明顯減少;其中紅豆杉+LY294002組腎臟纖維化改善較為明顯,見圖3。

圖3 各組大鼠腎臟膠原纖維的組織學變化

2.5 各組大鼠腎組織中PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的比較與對照組比較,模型組大鼠腎組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比值明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,厄貝沙坦組、紅豆杉組、紅豆杉+LY294002組大鼠腎組織中p-PI3K/PI3K、 p-AKT/AKT、 p-mTOR/mTOR的比值明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),其中紅豆杉+LY294002組大鼠腎組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比值降低最明顯,見表3、圖4。

表3 各組大鼠腎組織中PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達比較

3 討論

在糖尿病腎病早期,腎臟已經發生結構性病變,腎小球基底膜增厚,間質纖維化并伴有腎小管萎縮和動脈玻璃樣變性[10],晚期出現大量的淋巴細胞和巨噬細胞浸潤,超微結構上存在內皮細胞開窗減少或丟失[11]。腎小球病變、腎小管萎縮及間質纖維化是腎臟預后的獨立危險因素,腎小球和間質病變的嚴重程度與腎臟預后相關[12]。有研究表明,使用腎素-血管緊張素系統抑制劑可延遲糖尿病腎病進展,保護腎臟[13],但使用腎素-血管緊張素系統抑制劑治療時,應考慮對腎小球濾過率偏低或大幅下降患者帶來的潛在風險,因此尋找有價值的治療策略,對延緩糖尿病腎病的進展具有重要意義。紅豆杉在《本草綱目》有記載,適用于治療霍亂、傷寒和排毒,具有抗高血糖、抗驚厥、解熱、抗氧化、抗炎和鎮痛等多種生物學功能[14]。有研究表明,復方紅豆杉膠囊在肺腺癌的治療中具有顯著療效[15],其聯合化療治療內分泌耐藥晚期乳腺癌效果也良好,可改善患者臨床證候和生存質量[16]。基于此,本研究探討紅豆杉對糖尿病腎病大鼠腎功能的改善作用以及對PI3K/Akt信號通路的影響,以便為中醫藥防治糖尿病腎病提供合理的實驗依據。

本研究結果顯示,紅豆杉、紅豆杉+LY294002可降低FPG、24 hUTP、TC、TG、LDL、Scr和BUN水平,提高INS水平,且紅豆杉+LY294002效果最為明顯。說明紅豆杉在一定程度上保護腎臟免受糖尿病造成的損傷,改善血脂水平和腎功能。也有研究表明,紅豆杉對糖尿病腎病大鼠腎功能有一定的保護作用[17]。糖尿病患者中PAI-1水平增高可以抑制細胞外基質降解,導致腎部纖維化[18]。VCAM-1主要介導炎癥細胞在腎間質積聚,致使局部炎癥反應,調節基質的黏附、增殖和聚集,促進腎部纖維化[19],說明VCAM-1和PAI-1在糖尿病腎病的炎癥反應和腎部纖維化中起作用。本研究結果顯示,紅豆杉及紅豆杉+LY294002可降低VCAM-1和PAI-1蛋白表達,表明紅豆杉在一定程度上可降低炎癥反應。HE染色和Masson染色觀察結果顯示,紅豆杉及紅豆杉+LY294002可明顯改善腎間質、腎小管病理和腎臟纖維化,減輕腎小體腫脹。提示紅豆杉在一定程度上具有改善腎臟功能,保護腎臟組織,減輕腎部纖維化的作用,且紅豆杉+LY294002的作用最為明顯。PI3K/Akt信號通路參與糖尿病腎病腎小球內皮細胞增殖和血管新生[20]。PI3K是激活該信號通路的關鍵物質,可激活下游的蛋白激酶B(Akt),會將該信號通路激活,足細胞會分泌大量的Ⅳ型膠原,使細胞外基質增多,基底膜增厚,導致腎小球硬化[5]。可見PI3K/Akt信號通路在糖尿病腎病中起重要作用。本研究結果表明,紅豆杉、紅豆杉+LY294002可降低大鼠腎組織中p-PI3K/PI3K、 p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比值,其中紅豆杉+LY294002降低作用最為明顯。說明紅豆杉對PI3K/Akt信號通路具有調控作用。

綜上所述,紅豆杉可能通過抑制PI3K/Akt信號通路改善糖尿病腎病大鼠的腎功能,降低炎癥反應,減輕腎部纖維化,可為治療糖尿病腎病提供依據。