基于PINK1/Parkin通路介導的線粒體自噬探討泛酸對糖尿病腎病小鼠的影響

王孫萍, 代 培, 胡 浩, 王 穎, 孫宏峰, 吳淑馨, 郭翔宇

(1北京中醫藥大學, 北京 100029; 2西安市中醫醫院內分泌科, 西安 710021; 3北京中醫藥大學東方醫院內分泌科, 北京 100078)

糖尿病腎病(Diabetic kidney disease, DKD)是2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)最常見的微血管并發癥之一,是導致終末期腎病(End-stage renal disease, ESRD)的主要原因[1]。與不合并DKD的糖尿病患者比較,合并DKD患者的死亡率更高,且大多死于心血管事件[2-3]。因此,早期診斷和治療對延緩DKD進展,改善患者預后有重要意義。DKD的發生發展與B族維生素缺乏及其引起的代謝紊亂密切相關[4-5]。泛酸,又稱維生素B5,是B族維生素的重要成分之一。研究顯示,右泛醇作為泛酸的前體,對鏈霉菌誘導的大鼠肝臟、胰腺、心血管損傷具有保護作用[6-7],但相關研究仍較少。團隊前期研究發現,與糖尿病患者比較,DKD患者體內泛酸、二氫尿嘧啶、脲基丙酸和3′,5′-二磷酸腺苷的水平顯著下調,其主要參與泛酸和輔酶A生物合成途徑[8],但補充泛酸對糖尿病腎病的保護作用及相關機制尚不清楚。線粒體自噬是發生在線粒體上的選擇性自噬過程,自噬泡吞噬不健康或膜電位不平衡的損傷線粒體,以維持正常的線粒體穩態[9]。有研究證實,同源性磷酸酶張力蛋白誘導激酶1(PTEN-induced putative kinase 1, PINK1)/帕金蛋白(Parkin)信號通路是參與調節線粒體自噬的重要通路[10]。Li等[11]研究發現,在鏈脲佐霉素(Streptozotocin, STZ)誘導的糖尿病腎病大鼠模型中,叉頭框轉錄因子O1(Forkhead box transcription factor O1, FoxO1)過表達可通過激活PINK1/Parkin依賴的信號途徑促進線粒體自噬過程,減輕足細胞損傷。周廣旭等[12]發現,靈芝孢子可能通過PINK1/Parkin通路,激活腎臟保護性自噬,抑制腎臟細胞凋亡,減輕腎臟細胞損害,從而起到腎臟保護作用。因此本實驗通過構建DKD db/db小鼠模型,驗證補充泛酸是否有助于延緩 DKD的進展,進一步觀察其對FoxO1、PINK1、Parkin mRNA及蛋白表達水平的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器尿微量白蛋白試劑盒(批號:2307)、尿肌酐試劑盒(批號:2587)購自美國BECKMAN公司;HE染色試劑盒(批號:G1120)、PAS染色試劑盒(批號:G1280)購自索萊寶公司;總RNA提取試劑盒(羽朵生物,批號:00266);FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化,批號:KR118-02);Real-time PCR(全式金生物,批號:AQ131-01);PCR引物由上海捷瑞公司合成;RIPA裂解液試劑盒(索萊寶,批號:R0010);BCA蛋白濃度測定試劑盒(普利萊基因技術,批號:P1511-3);FoxO1(批號:18592-1-AP)、PINK1(批號:23274-1-AP)、Parkin(批號:14060-1-AP)、GAPDH抗體(批號:6004-1-1g)均購自美國Proteintech公司;p-FoxO1抗體(Affinity Biosciences公司,批號:AF3417);山羊抗兔、山羊抗小鼠(批號:A0208、A0216)購自碧云天生物;ECL發光液(Tanon科技,批號:180-501)。快速血糖儀(日本愛科來,批號:GT-1941);離心機(德國Sigma,批號:3K15);酶標儀(賽默飛科技,批號:muLISKANMK3);實時熒光定量PCR(美國BIO-RAD,批號:C1000);天能全自動化學發光分析儀。

1.2 實驗動物、模型制備及分組12只SPF級8周齡雄性db/db小鼠,同周齡6只雄性近交式C57BL/6J小鼠均購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司[動物生產許可證號:SCXK(蘇)2018-0008]。小鼠飼養于北京中醫藥大學SPF級動物實驗中心,室內溫度、濕度恒定,晝夜循環光線照射。所有小鼠普通飼料喂養,除實驗所需空腹禁食外,小鼠均自由進食和飲水。db/db小鼠是瘦素受體缺陷的自發性糖尿病小鼠模型,隨時間進展自發出現高血糖,在8 ～ 25周齡出現中、重度白蛋白尿,提示出現糖尿病腎病[13]。適應性喂養2周后,禁食12 h(晚19∶30—早7∶30),采用斷尾法并用血糖儀檢測空腹血糖,收集尿液檢測尿微量白蛋白、尿肌酐水平,計算尿微量白蛋白肌酐比值(ACR),空腹血糖≥11.1 mmol/L且尿ACR高于對照組(P<0.05)視為DKD造模成功[14]。將造模成功的12只DKD db/db小鼠隨機分為模型組和泛酸組,各6只;同周齡的6只近交式C57BL/6J小鼠作為對照組。本實驗通過北京中醫藥大學動物倫理委員會審批(批準號:BUCM-4-2019091601-3063)。

1.3 動物干預及標本采集泛酸組小鼠每日灌胃130 mg·kg-1·d-1的泛酸,對照組和模型組給予等體積蒸餾水,連續給藥8周。隨后處死所有小鼠,檢測血肌酐(Serum creatinine, Scr)。在冰上迅速分離兩側腎臟,稱重后,將1/2右腎固定于4%多聚甲醛,石蠟包埋,HE染色、PAS染色;其余腎組織置于-80℃冰箱保存,用于Western-blot和RT-qPCR檢測。

1.4 體重、空腹血糖測定在實驗開始時(第0周)、給藥第4周、給藥第8周分別稱定小鼠體重,禁食12 h(晚19∶30—早7∶30)檢測空腹血糖。

1.5 臟器指數、尿ACR、Scr檢測實驗結束后,取小鼠腎臟,稱定重量,計算臟器指數。臟器指數=臟器重量/體重×100%(此處臟器重量指雙腎重量均值);采集小鼠血清,全自動生化分析儀檢測Scr水平。禁食不禁水,代謝籠收集小鼠尿液,檢測尿微量白蛋白、尿肌酐水平,計算尿微量白蛋白與尿肌酐的比值(ACR)。

1.6 腎臟組織病理學觀察(1)HE染色:5 μm切片,常規脫蠟至水,蘇木素染色5 min,1%氨水返藍,蒸餾水沖洗,蘇木素染色 2 min,流水沖洗,梯度酒精、二甲苯脫水,封片,光鏡下觀察腎臟細胞組織形態學變化。(2)PAS染色:常規脫蠟,高碘酸液處理10 min,流水沖洗,擦干多余水分,Schiff染液染色10 min,流水沖洗,Mayer蘇木素復染,分化,水洗,返藍,水洗,梯度酒精、二甲苯脫水,封片,光鏡下觀察腎臟細胞組織形態學變化及糖原沉積情況。

1.7 RT-qPCR檢測FoxO1、PINK1和Parkin mRNA表達水平用總RNA提取試劑盒提取腎組織中總RNA。用 FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒將總 RNA 反轉錄成為cDNA。各基因相對水平使用Real-time PCR試劑盒在Applied Biosystems 7500上通過定量RT-qPCR 確定,倍數變化通過相對定量(RQ=2-△△CT法)計算。RT-qPCR所用引物見表1。

表1 RT-qPCR的引物序列

1.8 Western Blot檢測FoxO1、p-FoxO1、PINK1和Parkin蛋白表達水平取小鼠凍存腎臟組織,用RIPA裂解液試劑盒提取總蛋白,進行蛋白質濃度定量,根據蛋白樣品濃度加入上樣緩沖液,煮沸。制備凝膠。按100 μg/孔蛋白樣本上樣,電泳(90 V,10 min)過濃縮膠,調節電壓為100 V,至溴酚藍條帶移動至板底部時停止電泳。甲醇預處理PVDF膜,將蛋白質電轉移至PVDF膜上。轉膜后TBST溶液洗膜至完全脫色。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h,TBST溶液清洗。一抗(按說明書稀釋)4℃孵育過夜,TBST溶液洗膜15 min×3次。二抗(1∶5 000稀釋)搖床上室溫孵育1～2 h,TBST溶液洗膜15 min×3次。通過ECL發光法顯像,置于天能全自動化學發光分析儀中曝光拍照。使用Image J軟件對條帶進行灰度值分析。

2 結果

2.1 各組小鼠體重、空腹血糖情況比較與對照組比較,模型組小鼠體重、空腹血糖明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,泛酸組小鼠體重無明顯變化,但在給藥第4周、第8周空腹血糖均顯著降低,差異有統計學意義(P<0.01),見表2。

表2 各組小鼠體重、空腹血糖情況比較

2.2 各組小鼠臟器指數、Scr、尿ACR情況比較與對照組比較,模型組小鼠臟器指數顯著降低(P<0.01),Scr和尿ACR水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,泛酸組小鼠臟器指數無明顯差異,Scr有下降趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05),ACR水平明顯降低(P<0.01),見表3。

表3 各組小鼠臟器指數、Scr、尿ACR情況比較

2.3 各組小鼠腎臟組織病理學比較HE染色結果顯示,與對照組比較,模型組小鼠腎小球擴張,系膜細胞增生,可見炎癥細胞浸潤;泛酸組上述病理變化較模型組均有減輕。PAS染色顯示,與對照組比較,模型組腎小球擴張,紫紅色糖原數量增多,存在顆粒沉積;與模型組比較,泛酸組腎小球內紫紅色糖原數量減少,顆粒沉積減輕,見圖1。

注: A, 對照組; B, 模型組; C, 泛酸組。

2.4 各組小鼠FoxO1、PINK1和Parkin mRNA表達水平RT-qPCR結果顯示,與對照組比較,模型組FoxO1表達水平降低(P<0.05),PINK1和Parkin mRNA的表達水平顯著降低(P<0.01);與模型組比較,泛酸組FoxO1表達水平無明顯差異,PINK1和Parkin mRNA的表達水平升高(P<0.01),見表4。

表4 各組小鼠FoxO1、PINK1 和 Parkin mRNA表達水平比較

2.5 各組小鼠FoxO1、p-FoxO1、PINK1和Parkin蛋白表達水平Western-Blot結果顯示,與對照組比較,模型組p-FoxO1蛋白表達水平顯著升高,PINK1和Parkin的表達水平顯著降低(P<0.01)。與模型組比較,泛酸組p-FoxO1蛋白表達水平顯著降低,PINK1和Parkin的表達水平顯著升高(P<0.01),見表5、圖2。

注: A, 對照組; B, 模型組; C, 泛酸組。

表5 各組小鼠FoxO1、p-FoxO1、PINK1 和 Parkin蛋白表達水平比較

3 討論

DKD是T2DM常見的微血管并發癥及重要死亡原因,在全球范圍內的發病率逐年升高,因此探索DKD的輔助治療方式對延緩疾病進展,改善患者預后具有重要意義。有研究顯示,補充B族維生素對預防T2DM及其微血管并發癥具有重要作用[15-16]。相關研究證實,線粒體自噬功能障礙是影響DKD發生和發展的重要因素,其中,PINK1/Parkin信號通路是參與調節腎臟細胞線粒體自噬的重要通路[17]。故本研究旨在探討泛酸是否通過PINK1/Parkin通路介導的線粒體自噬發揮腎臟保護作用。

本研究選用與DKD患者的發病過程相類似的自發型DKD db/db小鼠模型[18],在小鼠10周齡時開始給予泛酸干預治療。結果顯示,給予泛酸第4周起,DKD db/db小鼠空腹血糖水平下降,經過8周的治療,補充泛酸可顯著降低尿ACR水平,改善腎小球擴張,糖原沉積等腎臟病理改變。這與Tutun等[19]的研究結果一致。因此,補充泛酸可能有助于保護腎功能,延緩DKD的進程。持續高血糖狀態導致活性氧過度產生,超出機體清除能力,引起線粒體損傷[20],損傷的線粒體與自噬相關基因上游蛋白在自噬小體形成位點處聚集,啟動線粒體自噬,隨后,隔離膜形成并逐漸延長,損傷線粒體被包裹形成自噬小體,并與溶酶體融合降解[21]。隨著病情進展,損傷線粒體過量增加,超出線粒體自噬清除能力,損傷線粒體不能得到及時清除,造成線粒體形態異常和功能紊亂,最終導致腎臟功能受損[22-23]。

線粒體自噬主要包括泛素依賴型和受體依賴型兩種途徑,其中PINK1/Parkin介導的線粒體自噬是一條經典的泛素依賴型途徑。在受損線粒體中,因膜電位喪失,PINK1在受損的線粒體外膜上堆積,并向胞質暴露其催化結構域,進而激活Parkin,介導受損線粒體與溶酶體結合最終被水解酶降解[24]。作為一種轉錄因子,FoxO1與PINK1啟動子上的特定位點結合并激活其轉錄,持續高血糖狀態激活PI3K/AKT等相關信號通路,進而磷酸化FoxO1蛋白,磷酸化的FoxO1從細胞核移位到細胞質,隨后失去功能[11]。磷酸化FoxO1比例的升高降低了PINK1的表達,Parkin激活受到抑制,進而導致損傷線粒體不能得到清除,線粒體異常分裂增加,DKD進展。本研究結果顯示,與模型組相比,泛酸組p-FoxO1蛋白表達顯著降低,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表達顯著升高,磷酸化的FoxO1比例的降低促進了PINK1的表達,進而激活線粒體保護性自噬,損傷線粒體得到清除,從而延緩DKD進程。

綜上所述,泛酸可降低DKD db/db小鼠尿ACR水平,減輕腎小球病理變化,其可能通過PINK1/Parkin通路,調節線粒體保護性自噬,保護腎臟線粒體功能,從而起到保護腎臟細胞功能,延緩DKD進展的作用。