STAT3 抑制劑S3I-201對人肝癌BEL-7402細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響

李玲玲 林斯曉 周文英 彭曉謀

肝癌是常見的消化道惡性腫瘤,也是我國第三大腫瘤致死病因[1]。其發病隱匿、進展快、惡性程度高、預后差,嚴重威脅著人類健康。在治療上Ⅰ和Ⅱ期患者以手術(肝切除術和肝移植術)為主,對Ⅲb期的晚期患者除了放療、經導管動脈化學栓塞( transcatheter arterial chemoembolization,TACE)等治療手段外結合靶向治療亦可使患者獲益[1]。

信號轉導和轉錄激活子3(STAT3)作為細胞內重要的信號轉導蛋白,密切參與了多種腫瘤的發生發展,可作為癌癥治療的重要靶點[2]。目前,以 STAT3 為靶點開發抗腫瘤藥物的研究越來越多。S3I-201是近年來鑒定出的一個 STAT3小分子抑制劑,能特異結合在STAT3的SH2結構域,從而阻斷STAT3的磷酸化/活化、STAT3-STAT3復合物形成及細胞核內STAT3-DNA結合活性,并最終抑制依賴于STAT3的轉錄活性[3]。S3I-201優先作用于持續性表達STAT3活化蛋白的腫瘤細胞,誘導其生長抑制和凋亡發生[4-6]。本文旨在探討S3I-201對肝癌細胞BEL-7402的增殖、細胞周期和細胞凋亡等的影響,為肝癌相關的靶向藥物研發和治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM、FBS、PBS 購自美國 Gibco公司;BEL-7402保存于中山大學附屬第五醫院中心實驗室;細胞培養皿(板);STAT3 抑制劑( 商品名 S3I-201)購自美國MCE公司;Cell Couting Kit-8(CCK-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒及Annexin V-FITC 凋亡試劑盒購自日本Dojindo公司;磷酸化STAT3、Bcl-2、Bax抗體購自美國Cell Signaling Technology (CST)公司;內參抗體、HRP標記的羊抗兔和羊抗小鼠購自Proteintech公司;EdU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物技術有限公司;預染蛋白質Marker為Thermofisher產品;蛋白提取RIPA試劑、BCA蛋白定量試劑盒、脫脂奶粉、PVDF膜浸潤活化液、細胞周期檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司;預制蛋白電泳凝膠為EZBiolab產品; Western blot 化學發光劑購自上海天能(Tanon)科技有限公司;FITC標記的羊抗鼠熒光二抗、DAPI染色液、抗淬滅封片劑購自武漢博士德生物技術有限公司;Q-PCR引物、RT試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTM購置TakaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養人肝癌細胞BEL-7402 用含10%胎牛血清的DMEM培養液(100 U/mL青霉素,100 μg/mL鏈霉素),在37 ℃、5% CO2的培養箱內貼壁培養。1～2 d換液,每3～4 d 進行傳代,實驗時選用對數生長期的細胞,取生長良好的3～6代用于實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 以對數生長期的BEL-7402細胞進行實驗,按照不同實驗條件處理后進行檢測。每孔加入10 μl CCK-8溶液,培養箱中孵育2 h,置于酶標儀中于450 nm下讀取OD值,根據公式:細胞存活率%=(加藥孔OD-空白OD)/(對照孔OD-空白OD)×100%,計算不同S3I-201濃度的細胞存活率,實驗重復3次,繪制細胞增殖曲線,計算IC50值。

1.2.3 EdU細胞增殖檢測 取對數生長期的細胞,以每孔1×105細胞接種于12孔板中,培養24 h后,S3I-201處理48 h,之后用20 μM溶液孵育標記6 h,PBS洗滌1～2次,每次5 min,4%多聚甲醛固定30 min,2 mg/mL的甘氨酸孵育5 min中和過量的醛基,PBS洗滌,0.5% TritonX-100通透細胞,1×Apollo和1×Hoechst33342染色、PBS洗滌后,用抗熒光淬滅封片劑封片,于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 流式細胞術進行細胞周期和細胞凋亡檢測 細胞凋亡檢測:藥物處理后的細胞經胰酶消化后用1×AnnexinⅤ Binding Solution制備成終濃度為1×106/mL的單細胞懸液,取100 μL該細胞懸液依次加入AnnexinⅤ,FITC結合物及PI Solution,室溫下避光孵育15 min,加入400 μL 1×AnnexinⅤBinding Solution,在1h內完成檢測。對照細胞設置了未染色組、AnnexinⅤ-FITC染色組及PI染色組,分別用于上機(Beckman Coulter Epics-XL)檢測中的電壓和補償調節。細胞周期檢測:采用PI染色法。用6孔細胞培養板接種細胞,每孔1.5×106個,細胞處于對數生長期,60%～70%匯合度后更換成含藥培養液,分別處理0 h、24 h、48 h后,收集細胞檢測;胰酶消化細胞1000 rpm,5 min沉淀細胞后,先用預冷的PBS洗2次,再1000 rpm,5 min沉淀細胞;重懸后的細胞懸液1000 rpm,5 min離心后,用1 mL預冷的70%乙醇輕混勻,4 ℃固定2 h以上,然后1000 g離心5 min沉淀細胞,預冷PBS洗一次,1000 g離心5 min再次沉淀細胞,加RNase A溶液及PI染色后上機檢測,應用ModFit LT 5.0軟件對細胞周期檢測的原始數據進行擬合。

1.2.5 蛋白質免疫印跡(Western blotting)檢測 收集處理后的細胞,RIPA提取總蛋白,BCA法測定總蛋白濃度,取30 μg蛋白樣品上樣,經SDS-PAGE電泳分離后將其轉移至PVDF膜上,洗膜后用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h,磷酸化STAT3、Bcl-2、Bax及內參抗體均以1∶1000 4 ℃孵育過夜。經TBST洗滌后,加入HRP標記的特異性二抗以1∶10000室溫孵育1 h,ECL發光顯影。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 S3I-201對BEL-7402細胞增殖的影響

S3I-201對BEL-7402細胞體外增殖的影響分別采用CCK-8和EdU法進行檢測,結果分別見圖1和圖2。經不同濃度的S3I-201作用48 h后,隨著藥物濃度的增加BEL-7402細胞存活率呈現不同程度的下降,差異有統計學意義(F=16.50,P=0.0001),其中藥物濃度為280 μM時即對細胞增殖的抑制作用達顯著水平(P<0.05)。IC50=343.9 μM。

圖1 S3I-201作用48 h對BEL-7402細胞體外增殖的劑量依賴性抑制作用

圖2 S3I-201對BEL-7402細胞增殖的抑制作用(×200)

采用EdU增殖法檢測S3I-201對BEL-7402細胞增殖的影響, 結果顯示:與對照組相比280 μM的S3I-201能顯著抑制BEL-7402細胞的增殖(圖2)。

2.2 S3I-201對BEL-7402細胞凋亡的影響

根據CCK-8結果,S3I-201的工作濃度采用230 μM,在此濃度下藥物可以發揮作用而又能使細胞保持較高的存活率。流式細胞術檢測結果顯示(圖3),S3I-201作用24 h后,發生早期凋亡(右下象限)的細胞比對照組顯著增加(P<0.05),藥物作用48 h后,發生早期凋亡的細胞急劇增加(P<0.001),達60.7%;S3I-201誘導BEL-7402細胞發生晚期凋亡的情況與誘導發生早期凋亡類似,即:藥物作用24 h后,發生晚期凋亡(右上象限)的細胞比對照組顯著增加(P<0.05), 48 h后,發生晚期凋亡的細胞數目急劇增加(P<0.001),達28.5%。

A為流式散點圖; B為析因設計的方差分析。圖3 S3I-201對BEL-7402細胞凋亡的影響

2.3 S3I-201對BEL-7402細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

用230 μM的S3I-201處理BEL-7402細胞后,提取細胞總蛋白進行Western blotting檢測。結果表明,S3I-201能極顯著下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(P<0.05),顯著上調促凋亡蛋白Bax的表達(P<0.05)(圖4)。

2.4 S3I-201對BEL-7402細胞周期的影響

將230 μM的S3I-201分別與BEL-7402細胞共培養24 h及48 h,結果顯示與對照組相比,共培養24 h后處于細胞周期不同時相(G0/G1,S,G2/M)的細胞數目沒有顯著變化(P>0.05);共培養48 h后G0/G1期的細胞數量顯著降低(P<0.05),S期細胞數量顯著升高(P<0.05),而G2/M的細胞比例沒有顯著變化(P>0.05)。可見,S3I-201能將BEL-7402阻滯于S期,從而影響其增殖(圖5)。

A為擬合的細胞周期圖; B為析因設計的方差分析。圖5 S3I-201對BEL-7402細胞周期的影響

3 討論

隨著基因組學、蛋白質組學等組學及分子生物學的不斷發展,肝癌靶向治療成為了傳統治療外非常重要的一種治療手段[7-8]。近年來,除索拉非尼(SOR)外,侖伐替尼、瑞戈非尼及卡博替尼等靶向藥物陸續在國內外上市,很大程度上提高了對肝癌的療效[9-10]。因此,開發新的靶向藥物以用于改善晚期肝癌患者的生存質量也是未來研究工作的重要方向之一。

Janus 激酶(Janus kinase,JAK)-STAT 信號通路主要介導由細胞膜向細胞核的信號轉導并激發轉錄過程。其中,STAT3作為STAT家族成員在許多癌癥中持續性高表達。持續活化的 STAT3進一步促進癌腫發展以及產生抗癌藥物抵抗,STAT3已成為治療癌癥的引人注目的靶點。目前,STAT3 非多肽類小分子抑制劑得到了迅速的發展,其中,基于計算機輔助藥物篩選技術得到的化合物S31-201及其衍生物是直接靶向STAT3蛋白的SH2結構域的小分子抑制劑。在本研究中,我們用S31-201對人BEL-7402肝癌細胞進行了量效和時效關系研究,結果表明:藥物濃度在0～400 μM區間時,隨著藥物濃度逐漸加大,對細胞的殺傷作用越顯著,最高達80%以上;分別于0 h、12 h、24 h、48 h、60 h等時間點用230 μM的S31-201進行時效關系分析發現,藥物作用24 h以前未見對細胞的明顯殺傷作用,但隨著作用時間的延長細胞存活率明顯下降,48 h存活率約80%,60 h時下降到約60%。

阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡是抗癌藥物發揮作用的重要方式。本實驗中我們的結果顯示:S31-201能阻斷BEL-7402肝癌細胞S期DNA的復制,發生細胞周期S期阻滯。當前抗肝癌藥物引起肝細胞癌發生周期阻滯的諸多研究中,肝癌細胞發生G0/G1、S及G2/M期阻滯均有報道[11-13],但以S期阻滯最為多見,推測與受試對象如藥物、細胞株、動物或組織等的不同有關。

細胞凋亡是一個主動死亡過程,可以被多種內在或外在的刺激誘發,是細胞對刺激的應答反應。本研究根據CCK-8的結果,選擇了230 μM的S31-201流式Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測BEL-7402肝癌細胞的凋亡情況,結果顯示隨著S3I-201作用時間的延長不管是早期凋亡還是晚期凋亡率都明顯增加。進一步用Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白的表達情況,結果顯示S3I-201能夠下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達和上調促凋亡蛋白Bax的表達。

綜上所述,STAT3小分子抑制劑S31-201能夠在體外阻滯BEL-7402肝癌細胞周期,使其停滯于S期,抑制BEL-7402的增殖,通過下調Bcl-2和上調Bax 的表達誘導細胞凋亡,更深入的分子機制以及在動物模型中的驗證工作仍在進行中。

該研究結果將為靶向STAT3的小分子藥物的作用機理及潛在的臨床應用提供一些有益的線索。