miR-199-3p通過靶向VegfA抑制大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變

周 悅，林靜娜

聯(lián)勤保障部隊第909醫(yī)院，福建 漳州 363000

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是全球最常見的代謝疾病,到2030年,糖尿病將成為人類死亡的第七大原因[1]。由于體內(nèi)過高的血糖水平,糖尿病可引起一系列并發(fā)癥,如微血管病變(視網(wǎng)膜病變、腎病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病)和大血管并發(fā)癥(動脈粥樣硬化)[2]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)主要表現(xiàn)為血管滲透性增加和血管閉塞,是成人視力損害和失明的主要原因[3]。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一種單鏈非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[4]。新近的研究認(rèn)為miRNAs在不僅在糖尿病發(fā)生過程中起到重要作用[5],一些miRNAs(miRNA-146、miRNA-195)參與了DR進(jìn)展[6],而miR-199-3p在DR中的作用卻未見報道。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑:大鼠視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞(美國菌種保藏中心),RNeasy試劑盒、Taq PCR Master Mix(中國Qiagen公司);miR-199-3p mimic、OE-VEGFA(GenePharma公司);Lipofectamine 2000(Invitrogen公司);SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司);RIPA裂解液(Solarbio公司);二奎啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司);右旋糖酐及其余試劑(Sigma-Aldrich公司)。

1.1.2 實驗動物 無特征病原體(specific pathogen free,SPF)SD大鼠雄性,體質(zhì)量200～250 g)[福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(SCXK-2021-03)],飼養(yǎng)在SPF級動物房內(nèi),溫度(23±1)℃,晝夜循環(huán)12 h,動物均可自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理:大鼠被隨機(jī)分為7組 :1)對照(Ctrl)組;2)糖尿病模型(model)組;3)Ctrl+miR-199-3p 陰性對照(miR-NC)+過表達(dá)VEGFR對照(OE-Con)(Ctrl+miR-NC+OE-Con)組;4)model+miR-NC+OE-Con(model+miR-NC+OE-Con)組;5)model+miR-199-3p-抑制劑(miR-inhibitor)+OE-Con(model+miR-inhibitor+OE-Con)組;6)model+miR-199-3p模擬物(miR-mimc)+OE-Con(model+miR-mimc+OE-Con)組;7)model+miR-mimc+過表達(dá)VEGFA(OE-VEGFA)(model+miR-mimc+OE-VEGFA)組,每組12只。模型大鼠通過單次注射鏈脲佐菌素(STZ,65 mg/kg)建立糖尿病模型,對照大鼠注射等體積0.9%氯化鈉溶液。上述各組病毒(Lentivirus)由上海吉凱基因公司制備并在預(yù)實驗中驗證了相應(yīng)的感染效率及效果。病毒在造模后注射至大鼠玻璃體(5 μL,3 μmol/L)內(nèi),6周后重復(fù)注射并在3個月后取材并進(jìn)行相關(guān)分析。為了確定造模的成功,在造模結(jié)束后隨機(jī)選取3只動物,左心室注射50 mg/mL FITC標(biāo)記的右旋糖酐。……