炙甘草來源的sRNA可能通過靶向TNF-α緩解輕度ADRS模型小鼠的肺損傷

姜振宇，王小娜，湯克功，陳明銳，蔣澄宇

中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 生物化學與分子生物學系，北京 100005

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種急性彌漫炎性反應性肺損傷,根據柏林定義可分為輕度(200<氧合指數≤300)、中度(100<氧合指數≤200)和重度(氧合指數<100)[1],迫切需要一種針對ARDS新的預防和治療方法。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)作為一種重要的炎性因子,參與免疫調節、發熱和炎性反應發生[2]。TNF-α在ARDS的發展過程中起到重要作用[3],在ARDS的患者中TNF-α的水平也有顯著上升[4]?，F有研究發現使用抗TNF-α類藥物的COVID-19感染患者,其呼吸衰竭的臨床恢復良好[5]。因此將TNF-α作為治療ARDS的靶點是一種可行的思路。傳統中藥(traditional Chinese medicine,TCM)的藥效已被臨床治療驗證了幾千年,在實驗室前期工作中鑒定出傳統中藥中存在湯劑體(decoctosome)[6]。湯劑體由多種小RNA(small RNA,sRNA)、脂質分子、蛋白質及小分子化合物組成,其中的多種sRNA被證明可以治療許多疾病[7-8]。這些sRNA能靶向成千上萬的基因,之前的研究構建了中藥sRNA數據庫[9],能從中篩選出靶向特定基因的sRNA序列。四逆湯具有溫中祛寒,回陽救逆的功效,由附子、干姜、炙甘草三味藥組成。本研究從四逆湯水煎液來源的sRNA中篩選出。本研究篩選出1條靶向TNF-α的sRNA——TNF-α-sRNA-9,并對其在體外和體內實驗中的藥效進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人肺腺癌細胞系A549、人單核細胞白血病細胞系THP1和人胚腎細胞系HEK-293T均購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心(北京協和細胞資源中心CRC/PUMC)。

1.1.2 小鼠:SPF級雄性BALB/c小鼠, 6～8周齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。

1.1.3 試劑:胎牛血清(Hyclone公司); Ham’s F-12細胞培養基、DMEM細胞培養基(Life Technologies公司); LipofectamineTM2000、LipofectamineTMRNAiMAX、TRIzol(Thermo Fisher Scientific公司); 雙熒光素酶報告系統檢測試劑盒(Promega公司); 反轉錄試劑(TaKaRa公司); 實時熒光定量PCR試劑盒LightCycler?480 SYBR Green Ⅰ Master試劑盒(Roche公司); BCA蛋白質定量試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]; PVDF膜(Millpore公司); GAPDH鼠源一抗,TNFα蛋白質兔源一抗和HRP-conjugated山羊抗小鼠二抗以及抗兔二抗(均武漢愛博泰克生物科技有限公司);小RNA(sRNA)[通用生物(安徽)股份有限公司合成]; NC-sRNA(蘇州瑞博生物技術股份有限公司合成); 質粒(蘇州泓迅生物科技股份有限公司構建); 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和poly(I:C)(Sigma-Aldrich公司); IL-1β ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒和TNF-α ELISA試劑盒(R&D Systems公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析:人類TNF-α的mRNA全長序列來源于NCBI(National Center for Biotechnology Information)。選擇TNF-α作為預測的候選靶基因,利用RNAhybrid(version 2.1.2)軟件對四逆湯來源sRNAs的靶基因進行預測,篩選條件:最小自由能(minimal free energy, MFE)≤-20 kcal/mol。

1.2.2 細胞的培養及轉染:將A549、THP1和HEK-293T置于37 ℃,50 mL/L CO2細胞培養箱中培養。sRNA用LipofectamineTMRNAiMAX轉染,濃度為100 nmol/L;質粒用LipofectamineTM2000轉染,濃度為1 mg/L。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測靶向關系:在psi-check2.0質粒上構建TNF-α-WT質粒和TNF-α-MUT質粒。96孔板培養HEK-293T細胞24 h后,將100 ng質粒用LipofectamineTM2000轉染,將100 nmol/L sRNA用LipofectamineTMRNAiMAX轉染。……