含活血通絡方血清對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞增殖作用的研究

陳吉 姚歡歡 李能

[摘要]?目的?探究含活血通絡方血清調控IncRNA?MEG3對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞（human?retinal?microvascular?endothelial?cells，hRMECs）增殖及凋亡的影響作用。方法?選取20只SD大鼠，采用隨機數字表法對10只大鼠灌胃活血通絡方，10只灌胃等量生理鹽水。灌胃結束1h后制備相應血清。分別采用5mmol/L葡萄糖或30mmol/L的D-甘露醇、葡萄糖溶液對hRMECs細胞進行誘導24h。按照誘導情況將細胞分為正常對照組（5mmol/L葡萄糖，n=6）、等滲組（30mmol/L?D-甘露醇，n=6）、高糖組（30mmol/L葡萄糖，n=6）、高糖+2.5%含藥血清組（n=6）、高糖+7.5%含藥血清組（n=6）、高糖+10%含藥血清組（n=6），相應血清干預24h。采用CCK-8法、酶聯免疫吸附法檢測細胞增殖情況及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，GSH-Px）含量；采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative?real-time?fluorescence?polymerase?chain?reaction，qRT-PCR）測定細胞IncRNA-MEG3?mRNA表達，采用流式細胞術測定細胞凋亡情況；采用蛋白免疫印跡法檢測NOX4、VAV2、血管表皮生長因子受體（vascular?epidermal?growth?factor?receptor，VEGFR）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide?3-kinase，PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B（protein?kinase?B，AKT）、p-AKT、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian?target?of?rapamycin，mTOR）、p-mTOR蛋白表達情況。結果?與正常對照組比較，高糖組細胞增殖率下降，MDA含量增加，GSH-Px含量降低，凋亡增加，IncRNA-MEG3?mRNA表達降低，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、NOX4、VAV2、VEGFR蛋白表達均升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。與高糖組比較，高糖+7.5%含藥血清組和高糖+10%含藥血清組細胞增殖率增加，MDA含量降低，GSH-Px含量升高，IncRNA-MEG3表達升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；高糖+2.5%含藥血清組、高糖+7.5%含藥血清組、高糖+10%含藥血清組的細胞凋亡下降，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、NOX4、VAV2、VEGFR蛋白表達降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論?含活血通絡方血清可介導IncRNA-MEG3調控相關蛋白表達來減少高糖誘導hRMECs細胞的凋亡。

[關鍵詞]?糖尿病視網膜病變；活血通絡方；IncRNA-MEG3；凋亡

[中圖分類號]?R285.5??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.17.018

Study?on?the?proliferation?of?human?retinal?microvascular?endothelial?cells?induced?by?high?glucose?in?Huoxue?Tongluo?formula?containing?serum

CHEN?Ji1，?YAO?Huanhuan1，?LI?Neng2

1.Department?of?Pharmacy，?Huzhou?Third?Peoples?Hospital，?Huzhou?313000，?Zhejiang，?China;?2.Department?of?Ophthalmology，?Hangzhou?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Hangzhou?310007，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?effect?of?Huoxue?Tongluo?formula?regulates?IncRNA?MEG3?on?the?proliferation?and?apoptosis?of?human?retinal?microvascular?endothelial?cells?（hRMECs）?induced?by?high?glucose.?Methods?Twenty?SD?rats?were?selected?and?10?rats?were?gavaged?with?Huoxue?Tongluo?formula?and?10?rats?were?gavaged?with?equal?amount?of?saline?according?to?random?number?table?method.?The?corresponding?serum?was?prepared?1h?after?the?end?of?gavage.?The?hRMECs?cells?were?induced?with?5mmol/L?glucose?or?30mmol/L?D-mannitol，?glucose?solution?for?24h.?Cells?were?divided?according?to?induction?into?normal?control?（5mmol/L?glucose，?n=6），?isotonic?（30mmol/L?D-mannitol，?n=6），?high?glucose?（30mmol/L?glucose，?n=6），?high?glucose+2.5%?drug-containing?serum?（n=6），?high?glucose+7.5%?drug-containing?serum?（n=6）?and?high?glucose+10%?drug-containing?serum?（n=6）?groups?with?the?corresponding?serum?intervention?for?24h.?Cell?proliferation?and?malondialdehyde?（MDA）?and?glutathione?peroxidase?（GSH-Px）?levels?were?measured?by?CCK-8?and?ELISA.?Cellular?IncRNA-MEG3?mRNA?expression?was?measured?by?quantitative?real-time?fluorescence?polymerase?chain?reaction?（qRT-PCR）?and?apoptosis?was?measured?by?flow?cytometry.?Protein?immunoblotting?was?used?to?detect?NOX4，?VAV2，?vascular?epidermal?growth?factor?receptor?（VEGFR），?phosphoinositide?3-kinase?（PI3K），?p-PI3K，?protein?kinase?B?（AKT），?p-AKT，?mammalian?target?of?rapamycin?（mTOR），?p-mTOR?protein?expression.?Results?Compared?with?the?normal?control?group，?the?high?glucose?group?showed?decreased?cell?proliferation?rate，?increased?MDA?content，?decreased?GSH-Px?content，?increased?apoptosis，?decreased?IncRNA-MEG3?mRNA?expression，?and?increased?p-PI3K/PI3K，?p-AKT/AKT，?p-mTOR/mTOR，?NOX4，?VAV2，?and?VEGFR?protein?expression，?all?with?statistically?significant?differences?（P<0.05）.?Compared?with?the?high?glucose?group，?the?cell?proliferation?rate?increased，?MDA?content?decreased，?GSH-Px?content?increased?and?IncRNA-MEG3?expression?increased?in?the?high?glucose?+7.5%?drug-containing?serum?group?and?the?high?glucose+10%?drug-containing?serum?group，?all?with?statistically?significant?differences?（P<0.05）.?Apoptosis?was?decreased?in?the?high?glucose+2.5%?drug-containing?serum?group，?the?high?glucose+7.5%?drug-containing?serum?group?and?the?high?glucose+10%?drug-containing?serum?group，?and?p-PI3K/PI3K，?p-AKT/AKT，?p-mTOR/mTOR，?NOX4，?VAV2，?VEGFR?protein?expression?were?decreased，?all?differences?were?statistically?significant?（P<0.05）.?Conclusion?Huoxue?Tongluo?formula?mediates?IncRNA-MEG3-regulated?protein?expression?to?reduce?apoptosis?in?hRMECs?induced?by?high?glucose.

[Key?words]?Diabetic?retinopathy;?Huoxue?Tongluo?formula;?IncRNA-MEG3;?Apoptosis

隨著社會的發展和人口老齡化進程的不斷加快，加上人群基因易感性，我國糖尿病患者的相對數量已超出許多國家[1]。糖尿病視網膜病變（diabetic?retinopathy，DR）是糖尿病常見眼部并發癥，主要病理改變為視網膜微血管病變和視網膜神經細胞功能障礙、退化[2]。糖代謝紊亂是導致DR的根本原因，持續的高血糖可損傷視網膜毛細血管內皮，繼而引起眼部多種病理改變[3-4]。IncRNA?MEG3表達下調能夠加重DR小鼠視網膜血管功能障礙[5]。活血通絡方具有益氣活血、通目絡之功效，對糖尿病大鼠的視神經組織具有保護作用[6]。基于此，本研究通過體外實驗，探討活血通絡方對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞（human?retinal?microvascular?endothelial?cells，hRMECs）的保護作用及對IncRNA?MEG3的調控作用。

1??材料與方法

1.1??動物及材料

SPF級雄性SD（sprague–dawley）大鼠，體質量（220±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005]。在浙江鷹旸生物科技有限公司動物中心[動物使用許可證號：SYXK（浙）2020-0033]進行常規飼養。飼養期間自由飲食水，保證每天光照12h，溫度20～22℃，相對濕度50%～70%。本研究經湖州市第三人民醫院倫理委員會審批（倫理批準號：ZJEY-20211116-03）。

hRMECs細胞購自美國Angio?Proteomie公司，活血通絡方由醫院藥房提供；胎牛血清購于美國Transgen?Biotech公司，DMEM培養基購于美國HyClone公司；CCK8試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，GSH-Px）檢測的酶聯免疫吸附法試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司；NOX4、VAV2、血管表皮生長因子受體（vascular?epidermal?growth?factor?receptor，VEGFR）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide?3-kinase，PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B（protein?kinase?B，AKT）、p-AKT、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian?target?of?rapamycin，mTOR）、p-mTOR蛋白抗體購于美國Affinity公司；逆轉錄試劑盒購于西隴化工股份有限公司。Micro17R型低溫高速離心機、BB150型細胞培養箱購于德國Thermo公司；CMaxPlus型酶標儀購于美國Molecular?Devices公司；CFX?Connect型實時熒光定量PCR儀購于美國Bio-Rad公司；Mastercycler型PCR儀購于德國Eppendorf公司；Nanodrop?one型mRNA定量儀購于德國Thermo公司；AE2000型顯微鏡購于美國Motic公司。

1.2??方法

適應性飼養SD大鼠1周。采用隨機數字表法對10只大鼠灌胃活血通絡方（42g/kg），10只灌胃等量生理鹽水，連續5d。灌胃結束1h后，對兩組大鼠進行頸動脈采血，離心得到含活血通絡方血清和正常血清，–20℃保存備用。正常血清稀釋，含活血通絡方的血清分別制備2.5%、7.5%和10%濃度的藥物血清。

采用10%胎牛血清的DMEM培養基培養hRMECs細胞，于37℃、5%CO2的恒溫細胞培養箱中傳代細胞。隨后采用5mmol/L葡萄糖、30mmol/L的D-甘露醇或葡萄糖誘導細胞24h[7]。按照誘導情況將細胞分為正常對照組（5mmol/L葡萄糖，n=6）、等滲組（30mmol/L?D-甘露醇，n=6）、高糖組（30mmol/L葡萄糖，n=6）、高糖+2.5%含藥血清組（n=6）、7.5%含藥血清組（n=6）、10%含藥血清組（n=6），相應血清干預24h。

1.3??觀察指標

①細胞增殖檢測：細胞接種于96孔板，吸棄上清培養基，更換新鮮培養基繼續培養24h。每孔加入10μl的CCK-8試劑，孵育1h。孵育結束用酶標儀測定各細胞孔和設置孔在450nm處的吸光度值，計算相應細胞增殖率。②細胞MDA、GSH-Px指標檢測：收集細胞，離心，吸取上清液進行收集。按照酶聯免疫吸附法試劑盒說明書，設置空白、對照孔和實驗孔，測定吸光度值，計算MDA含量及GSH-Px活性。③細胞lncRNA-MEG3mRNA表達檢測：采用Trizol法提取RNA，采用逆轉錄聚合酶鏈反應進行DNA擴增（引物序列：F：5-CATCTACACCTCACG?AGGG-3；R：5-ATCCTTTGCCATCCTGGTC-3），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative?real-time?fluorescence?polymerase?chain?reaction，qRT-PCR）檢測IncRNA?MEG3?mRNA表達。反應條件為變性95℃?10min，擴增反應為95℃?15s、60℃?60s、40次，溶解曲線為95℃?15s、60℃?60s、95℃?15s。采用2-△△CT法對結果進行相對定量分析。④細胞凋亡檢測：細胞接種于6孔板內，吸棄多余細胞培養液。預冷PBS緩沖液洗滌，調整細胞濃度至1×106個/ml。加入500μl結合緩沖液與細胞混合，離心棄上清液，100μl結合緩沖液重懸細胞。加入5μl?Annexin?V-FITC和10μl碘化丙啶抗體，輕微振蕩，室溫避光環境下孵育15min。400μl結合緩沖液重懸混勻細胞，采用流式細胞儀進行檢測。⑤細胞蛋白表達檢測：細胞裂解，離心提取上清液備用。采用BCA法測定總蛋白含量。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene?fluoride，PVDF）膜，封閉，以TBST緩沖液清洗。用稀釋后的抗體NOX4、VAV2、VEGFR、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR孵育，4℃搖床過夜。隔天取出后恢復室溫，以TBST緩沖液清洗，對應二抗孵育2h，TBST緩沖液再次清洗。采用蛋白免疫印跡法檢測，讀取ECL-化學發光儀對應數值，以β-actin做內參，計算各蛋白的相對表達量。

1.4??統計學方法

采用SPSS?16.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用Tukey分析，多組比較采用ANOVA單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??細胞增殖率比較

等滲組的細胞增殖率與正常對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），高糖組細胞增殖率顯著低于正常對照組（P<0.05）。高糖+7.5%含藥血清組、高糖+10%含藥血清組細胞的增殖率均顯著高于高糖組（P<0.05），見圖1。

2.2??MDA和GSH-Px含量釋放情況比較

等滲組細胞MDA、GSH-Px含量與正常對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。與正常對照組比較，高糖組細胞MDA含量顯著上升，GSH-Px含量顯著下降（P<0.05）。與高糖組比較，高糖+7.5%含藥血清組、高糖+10%含藥血清組的細胞MDA含量顯著下降，GSH-Px含量顯著上升（P<0.05），見表1。

2.3??lncRNA?MEG3?mRNA表達水平比較

等滲組細胞的lncRNA?MEG3?mRNA表達水平與正常對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），高糖組細胞lncRNA?MEG3?mRNA表達水平顯著低于正常對照組（P<0.05）。與高糖組比較，高糖+7.5%含藥血清組、高糖+10%含藥血清組lncRNA?MEG3?mRNA表達水平均顯著增加（P<0.05），見表2。

2.4??細胞凋亡情況比較

等滲組細胞凋亡情況與正常對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），高糖組細胞凋亡率顯著高于正常對照組（P<0.05）。與高糖組比較，高糖+2.5%含藥血清組、高糖+7.5%含藥血清組、高糖+10%含藥血清組細胞的凋亡率均顯著下降（P<0.05），見圖2。

2.5??對高糖誘導細胞蛋白表達的影響

等滲組細胞各蛋白表達與正常對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05），高糖組細胞NOX4、VAV2、VEGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達均顯著高于正常對照組（P<0.05）。與高糖組比較，高糖+2.5%含藥血清組、高糖+7.5%含藥血清組、高糖+10%含藥血清組細胞的NOX4、VAV2、VEGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達均顯著降低（P<0.05），見圖3、表3。

3??討論

糖尿病的主要危害在于其各種并發癥，持續的糖尿病病程與DR的病變程度增加有關[8]。DR的進展及病變分類包括血–視網膜通透性、血管內皮細胞減少、血管基底膜增厚、毛細血管閉塞、視網膜神經元和膠質異常等[9]。除了高血糖對內皮細胞的影響之外，過度的炎癥和氧化應激反應可影響視網膜組織細胞正常增殖[10]。臨床研究表明，活血通絡方的輔助治療對與DR患者的血糖控制及眼底滲血、出血、微血管瘤等癥狀改善均有顯著作用[11]。

本研究結果顯示，活血通絡方除了能夠減弱高糖對hRECs細胞增殖的抑制作用和促凋亡作用外，還能夠減少MDA水平，增加GSH-Px活性，減輕高糖誘導hRECs細胞的氧化應激損傷，這可能與活血通絡方的抗炎作用有關[11]。高糖環境會阻礙AKT表達并促進其磷酸化產物生成，激活下游信號通路進而造成視網膜內皮細胞凋亡[12]。Fang等[13]研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號激活可加重視網膜上皮細胞壞死；而IncRNA?MEG3能夠抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路表達，減輕糖尿病大鼠視網膜病變[14-15]。本研究結果顯示，高糖誘導可抑制hRMECs細胞IncRNA?MEG3表達，而活血通絡方則可逆轉這一抑制作用，同時PI3K/AKT/mTOR信號通路的磷酸化產物相應減少，提示活血通絡方可能通過促進IncRNA?MEG3表達抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路表達，以減少高糖誘導hRMECs細胞凋亡。

血管表皮生長因子（vascular?endothelial?growth?factor，VEGF）參與調控視網膜血管新生，因此VEGF抑制劑被用于DR治療[16]。李聰翀等[17]發現VEGF/VEGFR2/PI3K/AKT信號軸可介導血管新生調控。VEGF和VAV2高表達于肝血管生成和轉移活躍中的肝癌細胞中，抑制VAV2表達后，肝癌細胞血管形成和轉移能力下降[18]。而敲除視網膜細胞中NOX4表達可以減輕病理性視網膜血管生成[19]。本研究結果顯示，高糖誘導促進hRECs細胞VEGFR、NOX4、VAV2蛋白的表達，而活血通絡方能夠抑制這些促進血管形成相關蛋白表達，提示其可能具有抑制視網膜新生血管增殖作用，但其是否通過IncRNA?MEG3介導則還需要相關實驗進一步明確。

綜上所述，活血通絡方可通過促進lncRNA?MEG3表達抑制高糖誘導hRMECs細胞凋亡損傷及血管生成相關蛋白的表達，并促進細胞增殖。未來將基于IncRNA?MEG3表達，進一步深入探究活血通絡方對DR的改善作用及機制。

[參考文獻][1] ZHENG?Y，?LEY?S?H，?HU?F?B.?Global?aetiology?and?epidemiology?of?type?2?diabetes?mellitus?and?its?complications[J].?Nat?rev?Endocrinol，?2018，?14（2）：?88–98.

[12] 梅子寒，?楊杰，?王煒，?等.?基于PI3K/Akt通路探討脈絡寧注射液對早期糖尿病視網膜病變的作用[J].?中醫眼耳鼻喉雜志，?2020，?10（1）：?6–10.