用Sleeping Beauty 轉(zhuǎn)座子篩選肺癌相關(guān)基因及功能研究

朱祥平，高增鴻，馬若騖，汪瑾，劉穎，郭雅彬

肺癌作為全球最常見的癌癥之一，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。據(jù)估計，每年約新增200 萬病例及176 萬死亡病例［1］。肺癌分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）兩大類，其中前者約占85%［2］。非小細胞肺癌（NSCLC）包括腺癌（adenocarcinoma）和鱗癌（squamous cell carcinoma）［2］。肺腺癌中最常見的突變發(fā)生于KRAS 基因和EGFR基因，這兩個基因突變約占總突變的45%，同時約40%的腺癌及20%的鱗癌相關(guān)基因突變?nèi)蕴幱谖粗獱顟B(tài)［3-5］。近幾年關(guān)于肺癌成因的研究不斷深入，但仍遠遠不足，因此篩選肺癌相關(guān)基因具有重大意義，有助于為肺癌的診斷和治療提供新的靶點和思路。為研究肺癌發(fā)生的遺傳學機制，我們選用John Minna 教授實驗室開發(fā)的HBEC細胞（human bronchial epithelial cells）作為模型［6］。HBEC 源于人支氣管腺細胞，先后轉(zhuǎn)入了TERT 基因和CDK4 基因并敲低了P53 基因，使之成為永生化細胞。HBEC 不能在普通培養(yǎng)基中生長，需添加人表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和牛垂體提取物。用于制造突變的睡美人轉(zhuǎn)座子（Sleeping Beauty，SB）轉(zhuǎn)座子經(jīng)過改造，在兩端反向重復序列（inverted repeat，IR）之間為Gene Trap盒子的結(jié)構(gòu)［7］。盒子的兩端各有一個剪接受體（splicing acceptor，SA）和一個poly A 位點。兩端的轉(zhuǎn)錄本都能與之拼接造成轉(zhuǎn)錄提前終止。盒子的中部為鼠干細胞病毒（mouse stem cell virus，MSCV）的5′-LTR，其本身是一個強啟動子且具有增強子的作用，下游為剪接供體（splicing donor，SD）。它們啟動的轉(zhuǎn)錄可以和下游的外顯子拼接，造成基因的過表達。Gene Trap 與其兩端的IR 一起合稱為T2/Onc 盒子（T2/Onc cassette）［8］，是轉(zhuǎn)座子誘變中最常用的設(shè)計，既能引起基因的失活，又能引起基因的激活。近年來涌現(xiàn)出許多使用SB 轉(zhuǎn)座子篩……