K562細胞中N-乙?；D移酶10的RNA結合圖譜分析

李高原，王妍然，王 芳，余 佳

中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 醫學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005

表觀轉錄組在細胞、發育和疾病過程中起到重要作用[1]。在古細菌、原核生物和真核生物中,被發現的核糖核苷修飾已有約170種[2]。RNA分子上多樣的修飾意味著充分的調控潛力,可能調節信使RNA(messenger RNA,mRNA)命運。

N4-乙酰胞嘧啶修飾(N4-acetylcytidine,ac4C)是mRNA的一種修飾,有助于調節mRNA穩定性,提高翻譯效率,在核糖體生物發生及癌等發生過程中扮演著重要角色[3-4]。N-乙酰基轉移酶10(N-acety-ltransferase 10,NAT10)是目前唯一已知的ac4C “writer”蛋白,同時具有乙酰轉移酶活性和RNA結合活性[5]。NAT10調節DNA損傷,癌細胞的脂肪酸代謝,促進胃癌轉移,成骨分化,雄性精子發生等多種功能被揭示[6-10]。在造血發生、譜系分化及血液系統疾病發生發展過程中的作用仍有待研究。

運用紫外交聯免疫沉淀測序技術(enhanced UV crosslinking, immunoprecipitation, and high-throughput sequencing,eCLIP-seq),得到人慢性髓蛋白血病細胞系K562中NAT10結合的轉錄本集合,并通過生物信息學分析進行圖譜描繪,旨在為進一步揭示NAT10在造血細胞中的功能和調控機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人慢性髓原白血病細胞系K562(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心)。

1.1.2 主要試劑:胎牛血清FBS和PBS(Hyclone公司);RPMI 1640 培養基、TURBOTMDNase、SuperScript Ⅲ、磁珠(Thermo Fisher Scientific公司);4%～12% Bis-Tris, 10-well, 1.0 mm小型蛋白質凝膠、protein A beads(Invitrogen公司);特異性抗體(Abcam公司);裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4, 100 mmol/L NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate and 1×protease inhibitor cocktail, Roche公司);Wash buffer(Tris-HCl, MgCl2, NaCl, ddH20);ExoSAP-IT(Affymetrix公司);測序(Novogene公司)

1.2 方法

1.2.1 K562細胞的培養:將K562細胞培養于含10%胎牛血清FBS的RPMI 1640培養基中,控制匯合度在30%左右,置于37 ℃、含5% CO2的細胞箱中。每隔2～3 d對其傳代。傳代時收集細胞懸液,輕輕吹打,混懸成單細胞懸液,離心后棄去培養基,用含FBS的新鮮1640培養重懸,以1∶3～1∶4的比例傳代。……