?基于轉錄組測序的紫薇SSR特征分析?

摘 要：以紫薇葉片為材料，通過Illumina Hiseq X Ten測序平臺進行高通量測序，利用MISA軟件分析轉錄組的SSR相關信息。結果表明：測序共獲得31 461條Unigene序列，總長度34 408 463 bp，其中有5 617條Unigene序列含有SSR位點，共發現SSR位點6 761個，出現頻率為21.49%，平均分布距離為5.09 kb；主要的優勢重復類型為二核苷酸重復和三核苷酸重復，分別占總SSR的44.95%和36.41%；AG/CT和A/T為SSR優勢重復基元，出現頻率分別為40.23%（2 720個）和16.57%（1 120個）。分析表明，紫薇轉錄組中SSR類型豐富、位點出現頻率高、多態性潛力高，在紫薇種質遺傳多樣性研究、品種鑒定、雜種鑒定等方面具有應用價值。

關鍵詞：紫薇；轉錄組；SSR

中圖分類號：Q754 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2023）04-0001-04

Abstract：Illumina Hiseq X Ten sequencing platform was used to conduct high-throughput sequencing on Lagerstroemia indica leaves， and SSR related information of transcriptome was analyzed by MISA software. The results showed that a total of 31 461 Unigene sequences with a total length of 34 408 463 bp were obtained， among which 5 617 Unigene sequences contained SSR loci. A total of 6 761 SSR loci were found， with a frequency of 21.49% and an average distribution distance of 5.09 kb. The dominant repeats were dinucleotide and trinucleotide， accounting for 44.95% and 36.41% of the total SSR repeats， respectively. AG/CT and A/T were SSR dominant repeat primitives， with occurrence frequencies of 40.23% （2 720） and 16.57% （1 120）， respectively. The results showed that SSR types were abundant， loci appeared frequently， and polymorphism potential was high in the transcriptome of Lagerstroemia indica， which has application value in genetic diversity analysis， variety identification， hybrid identification and so on.

Key words：Lagerstroemia indica; transcriptome; SSR

紫薇（Lagerstroemia indica）屬千屈菜科紫薇屬落葉灌木或小喬木，具有花期長、花量大、抗逆性強等特點，是重要的夏季觀賞木本花卉，被廣泛應用于世界各地的園林景觀中[1-2]。紫薇栽培歷史悠久，最早的栽培記錄可追溯至我國東晉王嘉所著的《拾遺記》。經過長期選育，紫薇形成了豐富多樣的品種，目前全世界的紫薇品種已超過500個[3]。

SSR（Simple Sequence Repeats）又稱為微衛星DNA（Microsatellite DNA），是由1～6個核苷酸組成的短串聯重復序列，具有可變的重復次數和保守的側翼序列，因而可通過設計特異引物進行PCR以擴增串聯重復序列的多態性[4]。SSR具有共顯性遺傳、多態性豐富、重復性高等特點，被廣泛應用于物種親緣關系分析、遺傳多樣性分析、品種鑒定、雜種鑒定等研究中。董俊美等[5]基于山藥轉錄組數據挖掘了大量的SSR位點，并通過開發分子標記對來自河北省、河南省、山東省及福建省等山藥主產區的43份山藥種質資源進行了遺傳多樣性和親緣關系分析；胡光明等[6]基于獼猴桃全基因組數據篩選得到一批多態性高、通用性強的SSR引物，并對種質資源進行了基因分型及親緣聚類分析；張成才等[7]通過篩選薄殼山核桃核心SSR引物，構建了36個常見品種的特異分子指紋圖譜和分子身份證；谷艷鵬等[8]以花楸樹為母本、少葉花楸為父本進行種間雜交，利用篩選出的9對擴增結果穩定且具多態性的EST-SSR引物，對雜交F1代群體進行雜種鑒定，并對親本和雜交F1代群體的基因分離規律以及遺傳多樣性和遺傳關系進行分析。

隨著轉錄組測序技術的不斷進步，其成本越來越低，利用轉錄組開發SSR分子標記的技術也隨之得到普遍應用。該研究基于紫薇轉錄組高通量測序結果，對分布于轉錄組上的SSR位點信息及其序列特征進行分析，以期為紫薇種質資源親緣關系分析、遺傳多樣性分析、品種鑒定、雜種鑒定等提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用材料為紫薇的新鮮幼嫩葉片，采集于廣西壯族自治區林業科學研究院紫薇種質資源圃。采集時用干凈紙巾擦掉葉片表面的雜質，接著用離心管裝好迅速放入液氮中，帶回實驗室置于－80℃冰箱中保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取 使用Trizol法從紫薇樣品中提取總RNA，使用DNase I（TaKara）去除基因組DNA。文庫質量檢測合格后進行測序。

1.2.2 測序與拼接 通過Illumina Hiseq X Ten測序平臺進行高通量測序，獲得Raw reads后，去除基因列中包含接頭、含N和低質量的參考基因合成序列，從而得到Clean reads。接著采用Trinity軟件進行拼接，將每條基因中獲得的最長轉錄本作為Unigene，用于后續分析。

1.2.3 SSR位點搜索和數據分析 使用MISA軟件對獲得的Unigene進行SSR位點搜索，搜索標準為：含有1、2、3、4、5、6核苷酸重復的最小重復次數分別為10、6、5、5、5次。復合型核苷酸2個位點之間距離小于150 bp。將生成的數據用Microsoft Excel 2016軟件進行整理，對序列特征進行分析并繪制圖表。SSR的出現頻率為SSR位點總數與Unigene序列總數的比值；SSR位點的平均距離為序列總長度與SSR位點總數之比。

2 結果與分析

2.1 紫薇轉錄組SSR的分布特征

通過高通量測序技術獲得紫薇葉片轉錄組數據，接著利用MISA軟件進行SSR位點搜索，結果表明，在31 461條Unigenes序列中發現總計有5 617條序列含有SSR位點，其中含1個以上 SSR位點的序列有955條，搜索到的SSR位點總數為6 761個，SSR位點的出現頻率為21.49%。同時，搜索到包含復合型SSR位點的序列數為517個，占序列總數的9.2%。序列總長度為34 408 463 bp，SSR位點的分布距離為5.09 kb，即平均每5.09 kb出現一個SSR位點。

2.2 紫薇轉錄組SSR重復類型分析

紫薇轉錄組SSR重復類型情況如表1所示。各重復類型SSR按照豐度排序結果為二核苷酸重復＞三核苷酸重復＞單核苷酸重復＞四核苷酸重復＞五核苷酸重復＞六核苷酸重復。紫薇轉錄組中的SSR主要重復類型為二核苷酸重復，數量為3 039個，占比為44.95%，出現頻率為7.83%，平均距離13.98 kb；三核苷酸重復類型豐度次之，為2 462個，占比36.41%，出現頻率為9.66%，平均距離11.32 kb；第三是單核苷酸重復，數量為1 132個，占比16.74%，出現頻率為3.60%，平均距離30.40 kb。其中，二核苷酸重復、三核苷酸重復和單核苷酸重復數量之和達到所有SSR數量的98.1%。

2.3 紫薇轉錄組SSR重復基元分析

由表2可知，由單核苷酸重復到六核苷酸重復，重復基元的種類分別為2、4、10、19、18、16種，共69種。單核苷酸重復的優勢重復單元為A/T，數量為1 120個，占單核苷酸重復的98.94%，出現頻率為16.57%；二核苷酸重復的優勢重復單元為AG/CT，數量為2 720個，占二核苷酸重復的89.50%，出現頻率為40.23%；三核苷酸重復的優勢重復單元為AGG/CCT，數量為751個，占三核苷酸重復的30.50%，出現頻率為11.11%。四、五、六核苷酸重復的優勢重復單元分別為ACAT/ATGT、AGAGG/CCTCT、AAGGAG/CCTTCT，出現頻率均低于1%，分別為0.22%、0.09%和0.04%。轉錄組中主要SSR重復基元類型的和比例詳見圖1。

2.4 紫薇轉錄組SSR重復次數分析

SSR重復基元的重復次數決定了SSR序列長度的變化范圍，與其多態性密切相關。從表3可知，紫薇SSR位點重復基元的重復次數介于5～12次的比例達到90.56%，重復次數高于12次的比例為9.44%（638個）。頻率最高的是重復6次，共1 510個SSR位點，占比22.33%；其次是重復5次（1 288個，占比19.05%）；按占比的高低將剩余的重復次數排列依次是重復7次（827個，占比12.23%）、重復10次（790個，占比11.68%）、重復8次（640個，占比9.47%）、重復11次（427個，占比6.32%）、重復9次（336個，占比4.97%）和重復12次（305個，占比4.51%）。

3 討論與結論

由于成本低、效率高等優點，利用轉錄組開發SSR分子標記已成為常規手段。該研究基于紫薇轉錄組數據，共獲得Unigene序列31 461條，發現有5 617條Unigene序列含有SSR位點，SSR位點數量總計6 761個，出現頻率為21.49%。該研究中紫薇SSR的出現頻率高于黃稈烏哺雞竹的14.07%[9]、八角的14.24%[10]、柴胡的12.24%[11]，低于小果甜柿的31.52%[12]、睡蓮的33.98%[13]，與多頭菊的19.77%[14]、藍莓的20.81%[15]接近。在已有的利用轉錄組開發紫薇SSR的研究中得到的發生頻率為21.53%和20.03%[16-17]，與該研究的21.49%接近。通過搜索獲得序列的總長度為344 08 463 bp，SSR的分布密度為1/5.09 kb，與已有紫薇研究中的1/5.60、1/5.46 kb接近[16-17]，遠大于辣椒的1/56 kb[18]，低于野柿的1/2.94 kb[19]。

SSR的出現頻率和分布密度在不同物種間存在差異，而紫薇中SSR分布較緊密，數量較豐富。紫薇SSR主要集中在二核苷酸重復類型（3 039個，占比44.95%）、三核苷酸重復類型（2 462個，占比36.41%）和單核苷酸重復（1 132個，占比16.74%），三者總和為98.1%。已有研究表明，植物轉錄組測序獲得的SSR以單、二、三核苷酸重復基因為主，該研究結果與前人的研究結果一致。同時前人研究發現，SSR主導重復基元無明顯規律，分析認為這與物種差異、搜索參數設置差異等相關[20-21]。進一步分析發現，AG/CT的重復頻率最高（40.23%），隨后依次是A/T（16.57%）、AGG/CCT（11.11%）、AAG/CTT（10.81%）、AGC/CTG（5.72%），而其他重復基元占比均小于2.5%。雙子葉植物常見的重復基元有AG/ CT、AT/AT、AAG/ CTT、AG/ CT、AGC/ TCG等，分析認為這可能與密碼子的偏好性有關[22]。該研究對紫薇轉錄組SSR不同重復類型在不同重復下的數量進行統計，結果表明，在各重復類型中，重復次數最高的為6次（1 510個，占比22.33%），隨后依次是5次（1 288個，占比19.05%）、7次（827個，占比12.23%）、10次（790個，占比11.68%），其余重復次數（不含12次以上）的占比介于4.51%～9.47%之間。SSR的多態性與重復基元類型、頻率、重復次數等密切相關，該研究表明利用轉錄組開發具有多態性的紫薇SSR在理論上是可行的。

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（責任編輯：成 平）