貝萊斯芽孢桿菌在改善雪茄煙葉品質中的應用?

摘 要：以CX-014雪茄茄衣晾制結束后的煙葉為材料，對其進行微生物分離純化，從中篩選出了一株產酶豐富且酶活均處于中高水平的菌株H1，通過形態學和分子生物學方法對該菌株進行了鑒定，并探究了在雪茄煙葉發酵過程中添加外源苯丙氨酸和葡萄糖對該菌株降解煙葉中大分子物質、增加雪茄煙葉香氣成分的促進作用。結果表明：H1菌株被鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）；在添加外源營養物的條件下經菌株H1發酵后的雪茄煙葉中果膠降解率達到34.93%，淀粉、木質素、蛋白質和纖維素等大分子物質的含量也明顯降低；當接菌量為2.4×107 CFU/g，并添加0.25%苯丙氨酸和0.5%葡萄糖的外源物質的情況下，雪茄煙葉在37℃下發酵6 d后，煙葉中新增了異佛爾酮和2，5-十八碳二炔酸甲酯等香氣物質，且β-大馬酮、2-仲-丁基環戊酮等的含量明顯增多，香氣得到明顯改善。同時，菌株H1的產香發酵成本低，操作工藝簡單，可以在工業生產中推廣，以提高煙葉品質。

關鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌；雪茄煙葉；降解酶；品質；增香

中圖分類號：TS444 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2023）04-0082-08

Abstract：With the cured wrapper of a cigar tobacco CX-014 as material， a strain H1 producing abundant hydrolases of good activities was" selectively obtained through microbial isolation and purification. Then the morphologic observation and molecular biology method were used for its identification. Whether it could facilitate the hydrolysis of macromolecules and the formation of aroma substances in cigar tobacco during the fermentation process in the presence of exogenous phenylalanine and glucose was further explored. The identification results showed that strain H1 was Bacillus velezensis. Relying on fermentation by strain H1 along with adding exogenous nutrients， the degradation rate of pectin in cigar leaves reached 34.93%， and the contents of macromolecules such as amylum， lignins， proteins and cellulose also decreased significantly. After 6-day fermentation at 37℃ under the conditions of an inoculation amount being 2.4×107 CFU/g and adding 0.25% phenylalanine and 0.5% glucose，" some new aromatic substances like isophorone and 2， 5-octadecadiynoic acid methyl ester appeared， meanwhile the contents of β-damascenone and 2-sec-butylcyclopentanone significantly increased， so that the aroma note of the cigar tobaccos was improved markedly. In conclusion， the flavoring fermentation cost of strain H1 is low and the operation process is simple， so it can be popularized in industrial production to improve the quality of tobacco leaves.

Key words： Bacillus velezensis; cigar tobacco leave; hydrolases; quality; flavoring

未經醇化的雪茄煙葉雜氣較重，因此提高雪茄煙葉品質必需進行醇化，而在煙葉醇化過程中微生物的作用非常關鍵，雪茄煙葉經微生物發酵后其香氣變得豐富、柔和[1]。目前研究人員認為對雪茄煙葉進行發酵和醇化是改善煙葉品質的一個重要生化過程，其機理主要分為酶作用、微生物作用和化學作用3大類[2-3]。雪茄煙葉表面微生物能夠合成分泌多種胞外水解酶，這些酶可以加快淀粉、果膠、纖維素、蛋白質和木質素等大分子物質的降解，將其轉化為一些小分子化合物，使化學成分協調，減輕辛辣和雜氣，增加香氣化合物含量，最終改善煙草品質[4-6]。

煙草工作者在煙草發酵方面也進行了大量研究，例如以提高雪茄煙葉品質為最終目的，分離和鑒定發酵過程中雪茄煙葉表面的微生物。李志豪等[7]從雪茄外包皮煙葉上分離出蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）L-1，利用液態發酵方法研究了其產木聚糖酶的最佳發酵條件，分析比較該菌株對雪茄煙葉香氣物質成分及含量的影響，得出該菌有降解煙葉中纖維素和半纖維素的功能，從而改善煙葉中香氣物質的結論；薛磊等[8]從煙葉中篩選出可同時產蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的微生物菌株YBG-5、YDP-23和YBM-6，將菌株組合形成復合微生物配方噴施到煙絲上發酵，與對照組相比，發酵樣的煙氣細膩度得到改善，大分子物質含量下降明顯。

基于前人的研究，筆者以CX-014雪茄茄衣晾制結束后的煙葉為材料，對其進行微生物分離純化，從中篩選出了一株產酶豐富且酶活均處于中高水平的菌株，探究了在雪茄煙葉中添加外源苯丙氨酸和葡萄糖對該菌株降解大分子物質、增加雪茄煙葉香氣成分的促進作用，以期為微生物在雪茄煙葉生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發酵所用雪茄煙葉為2021年湖北省恩施州CX-014雪茄茄衣晾制結束后的煙葉。

主要試劑有酪素（上海伯奧生物科技有限公司）、D-（+）-半乳糖醛酸（上海源葉生物科技有限公司）、木質素（上海麥克林生化科技有限公司）、果膠（上海梯希愛化成工業發展公司），其他常規試劑（國藥集團化學試劑有限公司，其中二氯甲烷為色譜純，其余試劑均為分析純）。

主要培養基及其配方如下。（1）淀粉篩選培養基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH值 7.0～7.2，115℃滅菌30 min。（2）淀粉酶產酶培養基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨10 g，酵母粉0.5 g，氯化鈉1 g，磷酸氫二鉀 2 g，硫酸鎂0.1 g，氯化鈣0.1 g，硫酸錳0.001 g，去離子水1 000 mL，pH值7.0～7.2，121℃滅菌20 min。（3）蛋白質篩選培養基：脫脂奶粉5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH值7.0～7.2，115℃滅菌30 min。（4）蛋白質產酶培養基：蛋白胨7. 0 g，酵母粉 5. 0 g，葡萄糖 10. 0 g，磷酸氫二鉀4. 0 g，去離子水1 000 mL，pH值 7. 0，121℃滅菌20 min。（5）果膠酶篩選培養基：果膠5 g，蛋白胨2 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH值7.0～7.2，121℃滅菌20 min。（6）果膠產酶培養基：果膠5.0 g，蛋白胨1.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，硫酸銨1.4 g，尿素0.3 g，七水硫酸鎂0.3g，氯化鈣0.3 g，七水硫酸鐵0.005 g，一水硫酸錳0.001 56 g，七水硫酸鋅0.001 4 g，六水氯化鈷0.002 g，吐溫–80 1 mL，去離子水1 000 mL，pH值 6.0，121℃滅菌20 min。（7）纖維素酶篩選培養基：蛋白胨5 g，酵母粉5 g，羧甲基纖維素鈉10 g，氯化鈉5 g，磷酸二氫鉀1 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH 值7.0～7.2，121℃滅菌20 min。（8）纖維素產酶配培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，羧甲基纖維素鈉5 g，pH值7.0～7.2，去離子水1 000 mL，121℃滅菌20 min。（9）木質素篩選培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，苯胺藍2 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH 值7.0～7.2，121℃滅菌20 min。（10）木質素產酶培養基：堿性木質素2 g，葡萄糖 4 g，硫酸銨1.33 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鈉0.2 g，磷酸二氫鉀1 g，pH值 7.0，115℃滅菌30 min。（11）LB培養基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH值 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 雪茄煙葉中細菌的分離 稱取5 g發酵前的茄衣放入45 mL無菌水中，37℃、200 r/min搖床振蕩30 min，取0.5 mL液體，加到4.5 mL無菌水中，搖勻，反復稀釋得到10-4、10-5、10-6倍菌液。從10-4、10-5、10-6的稀釋液中分別吸取0.1 mL涂布于LB固態平板上，每個濃度下3個平行，于37℃培養48 h。長出的單菌落用滅菌的竹簽挑取進一步劃線分離，直到獲得純單一菌株。將不同形態特征的單菌落采用甘油保存方式，甘油管保藏于－80℃冰箱。

1.2.2 細菌降解能力檢測 將上述分離的細菌劃線于LB平板上培養出單菌落，再用滅菌后的竹簽挑取單菌落分別點接在淀粉、纖維素、木質素、蛋白質及果膠篩選固體培養基上，于37℃培養48 h。淀粉平板用碘液染色，果膠和纖維素平板用剛果紅染色，蛋白質平板和木質素平板可以直接看到透明圈，無需染色。通過觀察菌落周圍是否有透明圈的產生來判斷細菌是否具有降解相應大分子的能力。綜合上述結果篩選出可同時降解多種成分的細菌保存。

1.2.3 細菌酶活性測定 將初篩菌株在LB液態培養基中活化2次，再以起始OD 0.5/mL的接種量接入50 mL產酶培養基中，于37℃、200 r/min的條件下培養24 h。取產酶液在4℃、8 000 r/min離心10 min，吸取上清液作為粗酶液。采用DNS法[9]測定淀粉酶和果膠酶活性，參考姜心等[10]的方法測定纖維素酶活性，采用福林酚法[11]測定蛋白酶活性，漆酶（Lac）[12-14]、木質素過氧化物酶（LiP）[15]和錳過氧化物酶（MnP）[16-17]活性均參考相應文獻中的方法進行測定。根據初篩菌株產酶活性高低進行菌株復篩，選擇7種產酶活性均處于中高水平的菌株進行后續發酵效果研究。

1.2.4 菌種鑒定 將復篩菌株接種于LB固體培養基上，待菌落長出后，對菌株進行革蘭氏染色，同時在光學顯微鏡下觀察菌體形態特征。采用試劑盒提取菌株DNA，以復篩菌株DNA為模板，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）及1429R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增其16S rDNA片段。PCR反應條件：94℃ 10 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s，共30個循環；72℃ 10 min。PCR產物送昆泰銳生工生物工程（武漢）股份有限公司進行測序，在NCBI基因庫中進行菌株的同源性比對并構建系統發育樹，結合形態學觀察、革蘭氏染色結果及16S rDNA測序結果對菌株進行鑒定。

1.2.5 復篩菌株發酵液對雪茄煙葉大分子化合物的降解效果研究 將復篩菌株用LB液態培養基活化2次后，發酵液經8 000 r/min、4℃離心后棄去上清取下層菌體備用。稱取100 g雪茄煙葉，處理方式見表1。接菌量為2.4×107 CFU/g（煙葉重量），0.25%苯丙氨酸（煙葉重量），0.5%葡萄糖（煙葉重量），回潮后煙葉含水量為30%。將雪茄煙葉放在溫度37℃、相對濕度65%的恒溫恒濕箱中發酵7 d，發酵結束后將雪茄煙葉置于60℃烘箱中烘干粉碎，測定發酵前后雪茄煙葉中大分子化合物的含量。雪茄煙葉中淀粉含量采用酸解法測定[18]，纖維素含量采用纖維素含量試劑盒（索萊寶科技有限公司）測定，木質素含量參考相關文獻[19]進行測定，蛋白質含量采用翟羽晨等[20]的方法測定，果膠含量采用果膠含量試劑盒（索萊寶科技有限公司）測定。

1.2.6 煙草常規化學成分測定 （1）煙草樣品制備：按YC/T 31—1996進行。（2）水溶性總糖及還原糖測定：按YC/T 159—2002進行。（3）總植物堿測定：按YC/T 160—2002進行。（4）總氮測定：按YC/T 161—2002進行。（5）鉀測定：按YCT 173—2003進行。（6）氯測定：按YC/T 162—2011進行。

1.2.7 雪茄煙葉中香氣成分測定 使用同時蒸餾萃取技術（SDE）處理煙葉樣品，再使用氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）分析煙葉致香物質成分及含量[21]。

2 結果與分析

2.1 雪茄煙葉中產酶菌株的分離與篩選

將從雪茄煙葉樣品中分離出的16株細菌接種到不同種類的特定選擇性培養基中，測定其對淀粉、纖維素、木質素、蛋白質和果膠的降解能力，以菌株可同時降解物質種類的多少以及透明圈直徑和菌落直徑比（D/d）的大小作為篩選指標，結果見表2，共篩選出3株細菌，產酶豐富且透明圈直徑與菌落直徑比值較大，分別是H1、E7和F1。對3株細菌所產生的7種降解酶活性進行測定，結果（圖1）顯示，菌株H1的7種降解酶的酶活性均處于中高水平，所以選擇菌株H1進行后續試驗。

2.2 篩選菌種的鑒定

2.2.1 形態學觀察 菌株H1在LB培養基上生長良好，菌落呈圓形，乳白色不透明，會粘連，表面有凸起褶皺、干燥、邊緣些許不規則（圖2A），鏡檢顯示菌體呈長桿狀，經革蘭氏染色確定為革蘭氏陽性菌（圖2B）。

2.2.2 分子生物學鑒定 提取菌株H1的基因組DNA，使用通用引物擴增16S rDNA序列后進行測序，測序結果在NCBI網站進行BLAST比對，使用MEGA 7.0軟件建立菌株的系統發育樹（圖3）。菌株H1與Bacillus velezensis的同源性達到97%，初步鑒定菌株H1為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），并且在構建的系統發育樹中，菌株H1也與Bacillus velezensis處于同一分支。

2.3 不同處理煙葉中大分子化合物的降解情況

從表3可以看出，雪茄煙葉經H1菌株發酵后，5類大分子化合物相比于發酵前均有不同程度降低，且具有顯著性差異。發酵前雪茄煙葉中5類大分子物質含量如下：淀粉9.42%、蛋白質7.38%、果膠88.15 μmol/g、纖維素15.85%、木質素7.63%。添加菌株H1發酵的2組（處理3和處理5）雪茄煙葉中果膠、纖維素降解效果最為明顯，與處理1相比，果膠含量分別降低了19.61%和34.93%，纖維素含量分別降低了13.88%和14.38%；與處理2相比，果膠含量分別降低了2.90%和21.40%，但纖維素含量差異未達顯著水平；對比處理2和處理3～處理5煙葉中大分子物質含量，可知處理3～處理5均低于處理2，說明菌株H1和外源營養物質的加入有利于大分子物質的降解；外源營養物質的添加更有利于淀粉和纖維素的降解，可能是這些營養物質的加入促進了雪茄煙葉上其他可分泌淀粉酶和纖維素酶菌株的生長和代謝；處理5的大分子物質含量是所有處理組中最低的，說明添加外源苯丙氨酸和葡萄糖對菌株H1產生胞外酶降解大分子物質有一定促進作用。馬玲玲[22]從煙葉表面篩選分離出一株可以同時降解煙葉中淀粉和蛋白質的枯草芽孢桿菌，將該菌株應用于煙葉發酵，發現煙葉的淀粉含量下降了33.87%，蛋白質含量降低了20.00%；于少藤等[23]從煙葉表面分離鑒定出能有效降低煙葉中淀粉、纖維素、木質素、蛋白質及果膠含量的假單胞菌yc10，優化發酵條件后，發現煙葉中大分子物質的降解效果均有提升，發酵后煙葉中果膠的降解效果較為顯著，降解率超過30%，纖維素的降解效果次之，淀粉的降解效果稍弱，而木質素的降解效率最低（小于10%），這與筆者試驗結果基本一致。

2.4 不同處理煙葉常規化學成分分析

理化指標的變化可在一定程度上表征或預測雪茄煙葉吸食品質的變化，各指標含量的均衡性直接影響雪茄煙葉的品質[24]。其中，總糖和還原糖含量是衡量煙草品質的重要指標，與雪茄煙葉評吸質量呈顯著正相關，但雪茄煙葉屬于晾曬煙，因為晾曬煙調制時間長，糖類幾乎被呼吸作用消耗殆盡，所以調制后煙葉含糖極低[25]。由表4可知，發酵前雪茄煙葉還原糖和總糖含量最高，發酵后均有不同程度的降低，其中處理3的還原糖含量最低，可能是因為微生物生長過程中消耗了糖類物質，處理5的還原糖和總糖含量高于處理3，可能是因為添加了外源葡萄糖。發酵后煙葉的煙堿含量較發酵前均有明顯下降，其中處理5的煙堿含量最低，可能是菌株H1具有降解煙堿的能力。發酵后煙葉的總氮含量也有所下降，可能是煙葉中含氮化合物被降解所致。鉀氯比低于2的煙葉所制煙易熄火，鉀氯比在4以上的煙葉燃燒性較好[26]，各處理中除了處理3的鉀氯比小于4外，其余處理的鉀氯比均≥4，以處理4的鉀氯比最高，為4.76。理化指標分析結果初步表明，經過H1發酵處理后，雪茄煙葉的吸食品質有所改善。

2.5 不同處理煙葉中香氣成分的分析

煙草香氣成分是評價雪茄煙質量的重要指標之一，而煙草香氣是由致香物質成分和組成比例來決定的[27]。雪茄煙葉香氣成分十分復雜，按不同的致香基團可把雪茄煙葉香氣成分分為酸類、醇類、酮類、醛類、酯類、內酯類、酚類、氮雜環類、呋喃類、酰胺類、醚類及烴類等[28]。為了分析外源添加苯丙氨酸、葡萄糖以及菌株H1對雪茄煙葉中揮發性物質種類及含量的影響，通過GC-MS對發酵后雪茄煙葉進行檢測分析，利用NIST 11譜庫進行檢索，結果如表5所示，共鑒定出39種揮發性化合物，其中，醛類（10種）和醇類（13種）物質數量最多，其次是酮類物質（7種）、酸酯類物質（3種）、烴類物質（2種）、其他類（4種）。由表5可以看出，與發酵前的煙葉（處理1）相比，發酵后的煙葉香氣物質的總含量都有明顯上升，其中處理3、4、5的雪茄煙葉香氣物質總量與發酵前相比分別提高了1.62%、31.67%、33.83%；相較于處理2，處理3、4、5的雪茄煙葉香氣總量分別提高了0.95%、30.81%、32.95%，說明單獨添加外源苯丙氨酸和葡萄糖或者菌株H1都能夠提升煙葉香氣物質總含量，同時添加外源苯丙氨酸和葡萄糖以及H1菌株發酵則促進效果更加顯著。

為了確定H1對煙葉香氣物質形成的影響，分別了做了3組對照試驗，分別是：無菌水處理、0.5%葡萄糖與0.25%苯丙氨酸、貝萊斯芽孢桿菌H1混合處理。處理4和處理5中苯丙氨酸轉化產物相較于處理1分別提高了327.62%和294.87%，相較于處理2分別提高了203.03%和179.82%。處理4和處理5中苯丙氨酸轉化產物含量遠高于其余處理，可能是因為外源添加的苯丙氨酸在發酵過程被土著微生物和貝萊斯芽孢桿菌代謝轉化而成。

添加H1菌株進行發酵后，處理3和處理5的酮類化合物中新增了異佛爾酮、2，5-十八碳二炔酸甲酯，說明添加菌株H1發酵能夠產生新的物質，賦予煙葉新的特征香氣；添加外源苯丙氨基酸發酵后，處理4和處理5雪茄煙葉中苯乙醛、苯甲醛、苯乙醇、苯甲醇和異戊酸香葉酯含量較高，還新增了3-芐氧基-1-丙醇、鄰二甲苯。苯丙氨酸轉化產物是煙葉中重要的致香成分，是花香和果香香味的代表物質，可以豐富煙葉香氣，提高煙葉吸食品質，說明添加外源苯丙氨酸作為前體物質能夠使煙葉中苯丙氨酸的轉化產物含量得到提升，改善煙葉香氣。2-（4-甲基環己-3-烯-1-基）丙醛、2，5，8-三甲基-1-四醇、棕櫚油酸、7-十四碳烯等僅在處理5煙葉中出現，可能是菌株H1的代謝產物和苯丙氨酸在發酵過程中發生生物化學反應，催化煙葉的化學成分發生分解或轉化，使其轉變成為小分子的香氣物質，這些小分子物質可能是各種香味化合物前體物或中間產物。

圖4是雪茄煙葉中主要香氣物質做成的熱圖，包含煙草中常見的致香成分，例如異佛爾酮、β-大馬酮、苯丙氨酸轉化產物、異戊酸香葉酯等。其中，異佛爾酮具有涼爽的木質氣味和類似樟腦和皮革的氣味；β-大馬酮具有濃烈的玫瑰芳香[29]，賦予雪茄煙氣花香；苯乙醇和苯甲醇具有花香、玫瑰香；異戊酸香葉酯具有玫瑰香氣及蘋果甜味[30]。4-乙烯基愈創木酚在添加外源苯丙氨酸和葡萄糖的處理中略微上升，處理4和處理5的煙葉中4-乙烯基愈創木酚含量粉筆比處理2的增加了18.52%和20.54%，該物質具有強烈的香辛料、丁香以及炒花生氣味[30]，是辛香味的代表物質。由此可知，添加菌株H1和外源營養物質可以改善雪茄煙葉的香吃味。

3 討論與結論

目前，改善雪茄煙葉質量的主要措施是將對煙葉品質有顯著影響的大分子物質降解或通過發酵將它們轉化成小分子的香氣物質。該研究從雪茄煙葉表面篩選出1株降解大分子物質能力較強的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）H1，將其應用在雪茄煙葉的發酵中，可減少煙草燃吸過程中產生的有毒物質和刺激性氣體，增加雪茄煙葉中的香氣物質，改善雪茄煙葉品質。

Li等[30]從雪茄煙葉中篩選出一株可以產纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的貝萊斯芽孢桿菌，通過單因素和響應面法確定了雪茄煙葉發酵最佳工藝，發現在最佳工藝條件下雪茄煙葉中纖維素降解率最高可達31.69%，且雪茄的香氣物質含量增加了26.1%，β-大馬士酮、巨豆三烯酮、法尼基丙酮和茄酮含量顯著高于發酵前處理，說明功能性微生物的添加可以明顯改善煙葉的香氣質量。曾婉俐等[31]通過煙葉浸提物培養基篩選出一株甲基營養型芽孢桿菌HD-40，利用該菌株發酵煙葉，經GC-MS檢測發現，與未經菌株處理的煙葉發酵液相比，其所含的酯類、醛類、酸類等對香氣有貢獻的成分明顯增加，其中特別是3-羥基-2-丁酮的比例高達60%以上，表明該菌株發酵煙葉可產生明顯奶香味。張鵬等[32]從煙葉中篩選得到一株產果香型菌株R59，經鑒定其為產黑色素短梗霉，利用R59菌株發酵煙葉，經GC-MS檢測發現該菌株能夠產生11種香氣化學物質，其中苯乙醇、苯乙醛和醋酸異戊酯等含量較高，使煙葉呈現果香；將R59菌株的發酵液噴灑至煙絲表面后進行感官質量評價，發現噴灑的發酵液可有效改善煙絲的協調性、香氣和余味等。

通過分析雪茄煙葉樣品的香氣成分發現，只添加H1菌株而不添加外源物質發酵（處理3），雪茄煙葉中的醛類、醇類等香氣物質的含量均有所增加；而添加外源苯丙氨酸和葡萄糖的處理4和處理5中，苯丙氨酸代謝產物增多。苯乙醇、苯甲醇、苯甲醛、苯乙醛等是雪茄煙葉中重要的致香物質，與煙草的香氣特征密切相關。添加H1菌株的處理3和處理5中，酮類化合物中新增了異佛爾酮和2，5-十八碳二炔酸甲酯，可使煙葉具有獨特的香韻。

在添加外源營養物質的條件下經菌株H1發酵后的雪茄煙葉中果膠降解率達到34.93%，淀粉、木質素、蛋白質和纖維素等大分子物質的含量也明顯降低。當接菌量為2.4×107 CFU/g，并添加0.25%苯丙氨酸和0.5%葡萄糖的外源物質的情況下，雪茄煙葉在37℃下發酵6 d后，煙葉中新增了異佛爾酮和2，5-十八碳二炔酸甲酯等香氣物質，且β-大馬酮、2-仲-丁基環戊酮等的含量明顯增多，香氣得到明顯改善。同時，菌株H1的產香發酵成本低，操作工藝簡單，可以在工業生產中推廣，以提高煙葉品質。

參考文獻：

[1] 李秀妮，李 猛，萬德建，等. 煙葉微生物及其在煙葉發酵和醇化中的作用研究進展[J]. 微生物學通報，2019，46（6）：1520-1529.

[2] 趙銘欽，李芳芳. 微生物和酶學技術在煙草發酵中的應用及展望[J]. 中國農學通報，2007，23（1）：314-318.

[3] 張 磊，羅澤華，楊明川，等. 雪茄煙葉原料發酵微生物多樣性及酶活變化研究[J]. 中國農業科技導報，2021，23（10）：171-180.

[4] 牛 浩，周中宇，白金瑩，等. 雪茄煙發酵的研究進展[J]. 湖南文理學院學報（自然科學版），2020，32（4）：60-63，68.

[5] 張倩穎，羅 誠，李東亮，等. 雪茄煙葉調制及發酵技術研究進展[J]. 中國煙草學報，2020，26（4）：1-6.

[6] 徐清泉，李石頭，黃 申，等. 煙草源微生物及其應用研究進展[J]. 輕工學報，2021，36（5）：42-50， 58.

[7] 李志豪，張 鴿，貊志杰，等. 一株產木聚糖酶的蠟樣芽孢桿菌對雪茄煙葉成分及發酵產物的影響[J]. 生物技術通報，2022，38（2）：105-112.

[8] 薛 磊，趙漢文，李小斌，等. 微生物發酵對煙草品質及有害成分釋放的影響[J]. 陜西農業科學，2020，66（2）：20-25.

[9] HAASHEMI M，SHOJAOSADATI S A，RAZAVI S H，et al. Evaluation of Ca-independent α-amylase production by Bacillus sp. KR-8104 in submerged and solid state fermentation systems[J]. Iranian Journal of Biotechnology，2011，9（3）：188-196.

[10] 姜 心，陳 偉，周 波，等. 纖維素酶活測定影響因素的研究[J]. 食品工業科技，2010，31（5）：65-68.

[11] 王 帥，王楠楠，向佳樂，等. 一株蛋白酶產生菌的分離及鑒定[J]. 現代農業科技，2021（15）：210-212，215.

[12] 楊逸飛，雷雨田，趙天恒，等. 果膠酶產生菌的篩選鑒定和酶學性質研究[J]. 中國釀造，2021，40（9）：47-51.

[13] 劉梁濤. 高效木質素降解菌菌株的篩選、鑒定及漆酶性質的研究[D]. 新鄉：河南師范大學，2018.

[14] NILADEVI K N，JACOB N，PREMA P. Evidence for a halotolerant-alkaline laccase in Streptomyces psammoticus： purification and characterization[J]. Process Biochemistry，2008，43（6）：654-660.

[15] MING T E，KIRK T K. Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium[J]. Methods in Enzymology，1988，161：238-249.

[16] WARIISHI H，VALLI K，GOLD M H. Manganese（II） oxidation by Manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Kinetic mechanism and role of chelators[J]. The Journal of Biological Chemistry，1992，267（33）：23688-23695.

[17] KAPICH A N，PRIOR B A，BOTHA A，et al. Effect of lignocellulose-containing substrates on production of ligninolytic peroxidases in submerged cultures of Phanerochaete chrysosporium ME-446[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，34（2）：187-195.

[18] 何其芳，李榮華，郭培國，等. 煙葉中淀粉含量測定方法的比較[J]. 現代食品科技，2012，28（2）：229-232.

[19] 鄭艷紅，戴蕓蕓，楊 洋，等. 廢次煙葉提取液源木質素降解菌Bacillus subtilis SM降解特性[J]. 微生物學通報，2017，44（7）：1525-1534.

[20] 翟羽晨，王萬能，項鋼燎，等. BCA-TCA法快速測定煙草蛋白質的研究[J]. 河南農業科學，2017，46（9）：156-160.

[21] 胡志忠，姜 宇，龍章德，等. 利用產香酵母發酵技術改善煙葉品質[J]. 食品與機械，2018，34（11）：200-204.

[22] 馬玲玲. 同時高效降解煙葉中淀粉和蛋白質菌株的分離鑒定及其對煙葉理化成分的影響[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2015.

[23] 于少藤，毛淑蕊，胡安妥，等. 改善煙葉品質微生物的篩選及其作用效果研究[J]. 南京農業大學學報，2021，44（4）：766-777.

[24] 向 東，段淑輝，丁松爽，等. 不同成熟度雪茄煙葉晾制過程中顏色表征及主要化學成分變化特征[J]. 山東農業科學，2022，54（2）： 69-77.

[25] 李軍華，唐 杰，梁 坤，等. 印尼與國內雪茄煙葉主要化學成分差異分析[J]. 浙江農業科學，2015，56（7）：1080-1083.

[26] 金敖熙. 雪茄煙生產技術[M]. 北京：輕工業出版社，1982.

[27] 郭華誠，張月華，李陽光，等. 煙絲揮發性香味物質與卷煙感官質量的相關性研究[J]. 食品與機械，2019，35（1）：209-212.

[28] 景延秋，宮長榮，張月華，等. 煙草香味物質分析研究進展[J]. 中國煙草科學，2005，26（2）：44-48.

[29] 茅中一，洪祖燦，劉加增，等. 基于香氣活性值的福建尤溪煙葉提取物香氣特征成分分析[J]. 煙草科技，2020，53（10）：56-65.

[30] LI D Y，HUANG C Y，MAO Y H，et al. Screening of cellulase-producing bacteria and their effect on the chemical composition and aroma quality improvement of cigar wrapper leaves[J]. BioResources，2022，17（1）：1566-1590.

[31] 曾婉俐，許 力，蔣佳芮，等. 產香細菌的篩選及產香特性分析[J]. 基因組學與應用生物學，2020，39（2）：636-643.

[32] 張 鵬，李 煒，師 超，等. 一株產果香型真菌的篩選、鑒定及在煙草增香中的應用[J]. 中國煙草科學，2021，42（5）：95-101.

（責任編輯：張煥裕）