糖皮質激素誘導微血管內皮細胞損傷及凋亡與股骨頭壞死的關系*

李凡超 綜述，張 飛，彭吾訓△審校

(1.貴州醫科大學臨床醫學院，貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院急診科，貴陽 550004)

糖皮質激素(glucocorticoid,GC)廣泛用于治療各種炎癥和自身免疫性疾病，如器官移植、多發性骨髓瘤、腎病綜合征和類風濕關節炎等[1]。GC能減輕重癥肺炎導致的肺損傷，但大劑量GC增加股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)的發生率，且GC是引起非創傷性ONFH的最常見原因[2]。ONFH是一種致殘性疾病，如不及時治療，最終導致股骨頭塌陷及髖關節功能障礙，多數需行人工關節置換。GC導致ONFH的發病機制尚不明確，目前已形成多種理論體系，包括脂代謝紊亂理論、炎癥與細胞凋亡理論、血管栓塞理論、骨髓間充質干細胞成骨潛能下降理論等[3]。大量證據表明，微循環功能障礙在GC誘導ONFH的發病過程中發揮了關鍵作用。GC導致局部內皮功能障礙，如血流量減少、內皮細胞凋亡、血栓形成、功能性微血管稀疏等。在ONFH的發生、發展中，骨微血管內皮細胞(bone microvascular endothelial cells,BMECs)損傷及凋亡為中間環節。本文就GC損傷BMECs的機制、BMECs損傷與凝血功能障礙及成骨作用之間的關系進行綜述。

1 股骨頭BMECs的概述

股骨頭由于解剖位置特殊，血管分布少而弱，不易形成側枝循環，且血管較長及供血范圍較大，易引發供血不足和微血栓。骨微血管系統是骨微環境的重要組成部分。骨微血管不僅支持骨內各種細胞的代謝需求，還具有分泌功能。微血管網絡豐富，含有眾多分支，整體結構類似于珊瑚的形狀，毛細血管微動脈與微靜脈部分膨大、迂曲、互相纏繞，股骨頭軟骨血管與軟骨下平面呈垂直行走并擴張為血竇，然后轉折180°終止于骨靜脈，使得終末毛細血管與終末動脈相連。微循環功能障礙會影響新骨形成、骨吸收、營養物質轉運和骨微環境的平衡[4]。BMECs貼附于微血管內壁通過連接蛋白相互黏附，呈單層排布，其特點為有窗孔、無隔膜、孔間距較大、內皮基底膜不完整，便于成熟的紅細胞穿過[5]。BMECs自身具有分泌功能，分泌的血管分泌素和旁分泌因子調節其穩態和功能[6]，通過細胞旁和細胞外途徑調節營養物質和氧氣的主動運輸。股骨頭BMECs的特點[7]有調節細胞膜物質轉運及攝取、凝血及纖溶，合成和分泌血管活性物質，參與炎癥及免疫反應、血管生成、促進成骨等。

2 GC損傷BMECs的可能機制

BMECs在血管內皮構成中起重要作用，WEINSTEIN等[8]通過GC給藥建模，可見骨內血管結構發生水腫。GC引起骨髓水腫導致骨內壓增高，破壞血管穩態，進一步影響營養物質和氧氣的輸送、代謝產物的清除，加重骨壞死。BMECs損傷是股骨頭微循環功能障礙的共同環節，GC通過多種途徑損傷BMECs，如氧化應激(oxidative stress，OS)、骨內壓增高、內質網應激等。

2.1 OS

OS是由于活性氧(reactive oxygen species,ROS)過量產生，超過抗氧化防御能力，從而導致細胞功能喪失及組織損傷。高OS與各種骨骼疾病的發展有關，包括骨質疏松癥、骨腫瘤、類風濕關節炎和強直性脊柱炎[9]。在GC誘導ONFH的基因表達譜中發現OS相關基因Sod3、Cox6a2、Loxl2明顯下調[10]。GC會增加BMECs內ROS的濃度，且二者呈正相關[11]。ICHISEKI等[12]在家兔中使用GC后，血中抗氧化酶谷胱甘肽(GSH)明顯下降。GC通過多種途徑增加ROS的生成，細胞呈高OS狀態。OS在BMECs損傷及凋亡的病理生理過程中發揮重要作用[13]。OS可增加內皮細胞的通透性，降低線粒體膜電位，誘導內皮細胞凋亡。NO具有抑制內皮細胞的凋亡、血小板黏附和聚集的作用。大劑量GC增加超氧化物的生成，超氧化物與NO反應形成過氧亞硝酸鹽陰離子，使NO喪失生物活性，導致NO生物利用度降低從而促進內皮細胞凋亡。GC誘導OS可能是由于抗氧化酶表達降低而導致的，有實驗表明[14]，GC導致細胞保護酶下調和抗氧化水平下降；CHEN等[15]發現，股骨頭壞死區域的抗氧化酶發生明顯變化，表明壞死區域存在抗氧化水平下降。超氧化物歧化酶通過將超氧自由基還原為不穩定的過氧化氫來實現細胞抗氧化作用，從而保護細胞免受ROS的損害[16]。OS也可通過激活相關通路促進內皮細胞凋亡。OS激活p53通路[17]，促進凋亡相關Bax表達，增加線粒體膜的通透性，促進細胞色素C從線粒體中釋放到細胞質，激活Caspase-3，導致BMECs凋亡。

2.2 骨內壓增高

GC誘發高血壓與外周阻力增強有關。外周阻力增加的原因可能是功能微血管數量減少或毛細血管稀疏[18]。由于使用GC，皮下脂肪動員增加，血脂水平升高，脂質分布異常，脂肪在微血管內栓塞及在髓腔內堆積，髓腔內壓力增高，壓迫股骨頭的微小靜脈，導致毛細血管停滯，并抑制毛細血管的生長，骨內壓增高及微血管內脂肪栓塞導致BMECs損傷。GC可直接損傷內皮細胞，增強高凝性。BMECs通過產生、釋放NO和前列環素I2(PGI2)等血管活性物質，在血管張力的局部調節中發揮作用。6-酮前列環素F1是PGI2的代謝產物，被認為是內皮細胞損傷的標志物[19]。PGI2主要由血管內皮細胞產生，可擴張血管并抑制血小板聚集。HE等[20]在GC誘導的ONFH兔模型中發現，6-酮前列環素F1的水平明顯降低，這可能是GC損傷BMECs的一種方式。

2.3 內質網應激

內質網應激可誘導細胞凋亡的發生[21]，激活應激傳感器，包括蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)、激活轉錄因子6(ATF6)和需要肌醇的激酶1(IRE1)等，參與細胞穩態的調節。內質網應激是一把雙刃劍，內質網通過激活未折疊蛋白反應(UPR)來響應應激。感應到內質網被激活時，PERK齊聚并磷酸化自身，從而間接失活翻譯起始因子eIF2α并抑制翻譯，PERK有助于減少進入內質網的蛋白流量，緩解內質網應激。然而，強烈或長期的內質網應激會破壞UPR的體內平衡，激活凋亡的內源性和外源性途徑，隨后，PERK-CHOP信號通路被激活，誘導細胞凋亡[22]。長期使用GC會導致內質網應激，引起內皮細胞的功能障礙和凋亡。GAO等[23]證實在ONFH中GC上調了內質網應激相關蛋白的表達，通過PERK-CHOP信號通路導致微血管損傷和血管內皮細胞凋亡，PERK-CHOP為內質網應激的主要信號通路。

GC損傷BMECs由多因素共同作用引起，具體機制尚不明確。GC導致的BMECs損傷是ONFH病理過程的起始因素，BMECs損傷被認為是啟動骨內微循環凝血功能障礙的主要原因。

3 BMECs損傷與凝血功能障礙

血管內皮細胞構成血管壁的內層，在血管穩態中起重要作用。 內皮細胞的完整性是血液在體內維持流動狀態的基礎。內皮細胞不斷暴露在炎性和應激環境中,從而誘導內皮細胞損傷,分泌多種物質調節凝血相關過程。

血小板活化參與GC誘導的ONFH，大劑量GC誘導血小板聚集[24]，內皮細胞凋亡刺激血小板與內皮細胞結合，誘導血小板活化和血栓形成。內皮細胞能產生硫酸肝素及其他肝素樣蛋白聚糖，通過黏附抗凝血酶Ⅲ，使凝血酶及Xa失活發揮抗凝作用[25]。內皮細胞分泌各種信號和生物分子，以防止血小板的黏附和聚集。血栓調節蛋白(thrombomodulin，TM)是血管內皮細胞膜表面的一種跨膜蛋白，內皮細胞損傷導致TM水平下降。其主要功能通過內皮細胞調節止血，結合和隔離凝血酶，增加其親和力來激活C蛋白，使Ⅴa和Ⅷa失活。TM水平的降低是血栓性疾病發展的一個危險因素[26]。PGI2和NO是內皮細胞分泌的主要抗血小板物質，兩種物質協同增加血小板中的cAMP水平，從而防止其聚集[27]。MASUHARA等[28]發現血小板活化在GC誘導的ONFH中起著重要作用，在ONFH患者中顯示血小板活化明顯升高。此外，組織病理學觀察發現壞死區域附近的微血管中有血小板血栓形成[29]。血小板活化參與GC誘導的ONFH的進展，可能繼發于GC對BMECs的損傷。

內皮細胞可合成并分泌組織纖溶酶原激活物(tissue type plasminogen activator,t-PA)及纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1),使無活性的纖維蛋白溶酶原轉化為有活性的纖維蛋白溶酶，從而影響纖溶系統。DENG等[30]研究表明，高劑量地塞米松通過降低t-PA活性和增加PAI-1抗原水平抑制纖溶活性。PAI-1與t-PA形成復合物參與纖維蛋白溶解。GC增加PAI-1的活性，導致低纖溶和相對高凝狀態。α-2巨球蛋白(Alpha-2 macroglobulin，A2M)是存在于內皮細胞管腔表面的一種蛋白[31]。在GC誘導ONFH大鼠模型中，A2M基因表達明顯上調。A2M涉及止血和兒童血栓栓塞的發展過程，通過抑制纖溶酶和激肽釋放酶作為纖維蛋白溶解的抑制劑，并通過抑制凝血酶作為凝血的抑制劑[32]，因此，GC可以通過調節A2M表達改變內皮功能。微顆粒[33](microparticle,MPs)是血管內皮細胞在細胞活化或凋亡過程中釋放的小膜泡，具有高水平的促凝活性，MPs有助于ONFH相關的高凝狀態和微血管血栓形成。MPs直接誘導內皮細胞功能失調，并激活血栓級聯。

大量證據表明[34]，過量GC可引起高脂血癥、脂肪在股骨頭髓內組織中沉積、脂肪栓塞。這些因素通過骨內壓力升高、血流量減少而引起缺血，血脂異常還導致高凝狀態，加重缺血，最終導致ONFH。SHAH等[35]發現脂肪栓子誘導骨內纖維蛋白血栓形成，并推測脂肪栓子可能觸發血管內凝血，此外，損傷的骨髓脂肪細胞釋放出一些血管活性物質。低纖溶和血栓形成在ONFH中起重要作用，如果引起凝血功能異常，可通過抗凝治療改善。GLUECK等[36]研究了由遺傳性血栓形成或低纖溶引起的ONFH患者，在股骨頭塌陷前用依諾肝素治療12周，既能穩定病情發展，又能緩解疼痛。依諾肝素和洛伐他汀聯合治療可降低GC誘導的ONFH在家兔中的發生率[37]。凝血異常和血脂異常在GC誘導的ONFH中起重要作用。但纖維蛋白溶解或血栓形成與ONFH之間的關聯尚不清楚，ZHANG等[38]指出血友病與ONFH并沒有關聯，并認為BMECs損傷是ONFH發生更可能的原因。

BMECs損傷是GC誘導ONFH的中間環節，GC明顯影響BMECs的轉錄組。LI等[39]實驗中也顯示了高凝劑和低纖溶環境下BMECs的損傷，GC引起的高脂狀態也會導致BMECs的損傷。KERACHIAN等[40]指出，BMECs的凋亡可激活血栓級聯，引起缺血和梗死。GC通過多條信號通路誘導BMECs凋亡，促進血栓形成[41]。隨之而來的是血管問題(血流不暢、血栓形成、缺血缺氧)，血管問題反過來導致內皮細胞損傷，這可能是惡性循環，最終導致ONFH。

4 BMECs損傷與成血管-成骨耦聯

骨骼脈管系統在骨骼發育、重塑和體內平衡中起著至關重要的作用。新骨形成和骨折愈合均需要脈管系統的支持，骨修復和骨重塑都涉及血管生成和成骨途徑之間的相互作用，微血管與成骨作用最為密切。微血管最重要的組成部分是BMECs，它不僅起著高滲透性屏障的作用，還能分泌成骨調節因子促進成骨細胞及其祖細胞的增殖和分化，啟動骨重塑。BMECs損傷必定破壞血管與成骨之間的偶聯作用。正常條件下，BMECs保持靜止狀態。然而當組織損傷或缺氧，BMECs通過高度協調的血管發芽過程形成新血管，血管生成完全由局部血管內皮細胞維持[42]。血管生成包括血管擴張、基膜降解、內皮遷移、趨化、血管通透性增加，最終發生內皮細胞增殖和血管形成。多種生長因子和轉錄因子控制著血管生成的微調平衡。

血管生成的啟動主要是由血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)驅動，VEGF是強大的促細胞分裂劑，通過與VEGF受體結合發揮血管生成作用[43]。有研究證實[44]Notch活性在促進血管生成和成骨中起重要作用，DLL4是BMECs中關鍵的Notch配體，是生長的血管系統中發芽和有絲分裂的強大介質。VEGF與受體激活的血管內皮細胞表達Notch。Notch與配體DLL4整合觸發內皮細胞調節Noggin的分泌，Noggin調控骨前體細胞的招募和分化，從而促進骨形成，加速鄰近生長板中軟骨細胞的肥大和成熟[45]。Notch信號的破壞不僅損害骨血管的形態和生長，而且導致成骨減少，軟骨細胞缺損，長骨縮短，小梁骨丟失和骨量減少[46]。此外，VEGF通過激活PI3K和PKB途徑來促進內皮細胞存活。藥理抑制PI3K或轉染Akt突變體可消除VEGF的抗凋亡作用。VEGF也可引起NF-κB配體(RANKL)的上調[47]。RANKL通過PI3K/Akt信號轉導途徑維持內皮細胞的存活，并強烈刺激血管生成。

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一個細胞因子亞群，通常被稱為轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGFβ)超家族的成員。目前，BMP-2在脈管系統中無處不在，BOULETREAU等[48]在缺氧或VEGF刺激的BMECs中發現，BMP-2 mRNA和蛋白表達增強，直接影響骨重塑。BMP-2可以通過調節骨發育和修復中的一系列細胞過程(包括增殖、分化、遷移、凋亡和黏附)來促進骨礦化基質的形成和骨折再生[49]。BMP誘導成骨是通過上調成骨相關基因 (如Runx2、Osx和Col1a1) 的表達來介導的[50]。當BMECs受損，BMP表達下調，必然影響血管生成和成骨耦合。

缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factors,HIF)是細胞適應缺氧的主要調節劑。當BMECs損傷時，局部氧氣供應減少。缺氧對紅細胞、微血管、促紅細胞生成素和VEGF的產生均有一定影響[51]。近年來，已證明缺氧是血管生成與骨形成之間緊密結合的主要驅動力之一。缺氧可以降低HIF不同部位的羥基化，使HIF避免降解和失活，HIF的關鍵作用是增加VEGF的積累，導致骨血管密度增加，也可調節促紅細胞生成素增加Runx2介導的成骨作用，引起骨量增加。然而，血氧含量降低會導致代償性紅細胞增殖，血液黏度增加，血流動力學改變[52]。所有這些變化都會使血液高凝，促進血栓形成，減少有效血管體積，從而加重ONFH。缺氧也可加強GC的作用，通過增加Dkk-1的表達，上調GC受體活性而加重ONFH[53]。OKADA等[54]發現在ONFH患者的股骨頭內皮細胞中HIF高表達，在BMECs中轉染HIF誘導p21介導的細胞周期阻滯和內皮細胞凋亡。HIF是否有利于血管生成和成骨耦合尚不清楚，需要進一步探索。

骨骼中的血管發育與成骨是相關的，KUSUMBE等[55]確定了在骨骼系統中存在的一種新的毛細血管亞型——H型血管內皮細胞，分泌蛋白Noggin以維持負責骨形成的成骨細胞和軟骨細胞；分泌VEGF以支持血管生成，并將血管生成與成骨耦合。H型血管內皮細胞分泌支持血管生成的多種生長因子，調節骨脈管系統的生長，在“成血管-成骨耦聯” 過程中發揮重要作用。BMECs損傷及凋亡引起毛細血管再生困難，血管稀疏，骨微血管高凝狀態，微血栓形成，導致股骨頭微循環功能障礙。骨微循環功能障礙打破二者的耦聯過程，中斷成骨過程所需的氧氣和營養及必要的成骨調節因子，導致成骨能力下降，最終導致ONFH。

5 總結與展望

GC損傷BMECs引起股骨頭微循環功能障礙在ONFH的發生、發展中起重要作用。對于ONFH的發病機制，GC一直是人們研究的重點。GC損傷BMECs的機制尚不清楚，但血管損傷是ONFH 病理過程的起始因素逐漸被認可。近年來，隨著精準醫學的發展及干細胞和分子生物學的研究，上述觀點不斷得到證實。但BMECs損傷在GC引起的ONFH扮演什么樣的角色尚不清楚，從血管與成骨之前耦聯作用方面探討BMECs的作用機制研究甚少。進一步深化對BMECs的了解對于闡明ONFH的病理過程至關重要，這為ONFH的早期治療提供了一種新的思路和方法，也將成為該領域的研究熱點。