單倍型造血干細胞移植后疾病復發患者腸道微生態改變的臨床分析*

楊 曦，黃家文，蒲文琪，李成龍,葉雪梅,毛 妍，黃曉兵△

(1.電子科技大學附屬醫院/四川省人民醫院血液內科，成都 610000;2.成都東籬醫院血液內科，成都 610000)

異基因造血干細胞移植是目前治愈急性白血病最有效的方法。近年來，單倍型造血干細胞移植技術突飛猛進，日臻成熟。相較于同胞全相合移植，單倍型造血干細胞移植具有遠期復發率低的優勢，但很多患者仍不可避免的遭遇復發。復發患者往往對化療藥物耐藥，化療后造血恢復慢，容易合并重癥感染，導致生存期大大縮短。一項351例移植后復發的單中心大樣本回顧性分析提示：移植后復發患者的3年總生存期(OS)僅有19%[1]。 腸道是人體免疫系統中關鍵的一環，體外各種物質透過飲食與腸道細胞及共生菌群交互作用，最終形成免疫屏障以保持人體健康[2]。小鼠的體內實驗證實，移植預處理損傷、抗菌藥物使用、感染等因素，會對腸道微生態造成不同程度的損傷，進而增加移植后移植物抗宿主病(GVHD)的發生率[3-4]。最近的一項大樣本研究分析了來自4個不同中心的1 362例異基因造血干細胞移植患者(主要為同胞全相合和非血緣移植)的8 767份糞便樣本，同樣顯示了較低的腸道多樣性與移植相關死亡(TRM)和重度GVHD存在明顯相關性[4]。PELED等[5]通過對前瞻性收集的糞便樣本進行16S核糖體測序，對541例接受異基因造血干細胞移植(71%為非血緣移植)治療的患者腸道微生態情況分析發現，腸道菌群中一組細菌的豐度與移植術后疾病復發、進展之間存在關聯，這也許可作為潛在的生物標志物或治療靶點來預防移植后復發并提高生存率。與同胞全相合移植和非血緣移植相比，單倍型造血干細胞移植在免疫重建、復發方面具有自身的獨特性[6-7]，主要體現在免疫重建后期的免疫耐受上。單倍型造血干細胞移植由于持續存在人類白細胞抗原不相合導致的異體反應性T細胞，使患者持續獲得移植物抗白血病效應(GVL)，因此復發率明顯低于同胞全相合移植。這種GVL的實現，與腸道微生態存在關聯，而具體的相關性尚不清楚。因此，本研究探討單倍型造血干細胞移植后疾病復發患者腸道微生態的改變。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年8月至2021年8月于四川省人民醫院行異基因造血干細胞移植患者38例為研究對象，分為術后出現疾病復發(復發組19例)和術后未出現疾病復發(對照組19例)，配對成19對。所有患者采集糞便樣本前1個月內不能使用腸道菌群制劑、廣譜抗生素。患者臨床信息見表1。

表1 患者臨床信息(n=19)

1.2 方法

1.2.1糞便標本微生物的擴增子測序

所有患者收集糞便，立即置于無菌采樣盒內，-80 ℃低溫冷凍保存。取 200 mg樣品采用QIAamp DNA Stool Mini Kit 試劑盒(QIAGEN)快速提取和純化 DNA，委托協云基因信息技術有限公司完成16S rDNA基因測序，使用QIIME軟件進行測序數據處理并對獲得的高質量序列進行分析比對。

1.2.2糞便標本病原微生物宏基因組二代測序(mNGS)檢測

在38例(19對)患者中，根據擴增子結果，為進一步明確差異病原菌具體的種名及相關生物信息學特性，選擇其中有代表性的14例(7對)患者的糞便標本進行病原微生物mNGS檢測，委托協云基因信息技術有限公司完成。提取送檢樣本中的所有核酸物質，包括DNA/RNA，進行高通量測序，經過專用病原數據庫比對與生物信息學分析，基于物種和功能豐度信息進行豐度柱狀圖、 Alpha多樣性、 beta多樣性及基于Wilcox 秩和檢驗、LEfSe 多元統計分析及代謝通路比較分析，以挖掘樣本(組)之間物種和功能組成的差異。另外，基于以上宏基因組標準分析的結果進行一系列高級分析，例如 NMDS、CCA/RDA、Network、 CAG/MGS、腸型分析、ARDB 抗性基因注釋等分析；同時，可以結合轉錄組、代謝組及蛋白組數據進行多組學的關聯分析評估糞便菌群的種類、多樣性、代謝通路等指標[8]。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 Alpha多樣性指數分析

在復發人群中出現了Alpha多樣性指數的上升趨勢，代表其腸道中微生物數目趨于增加。這種增加的趨勢結合物種構成及差異分布情況來看，提示在復發人群中有害菌有升高趨勢,見圖1。

A：Observed OTUs組間分布情況；B：Chao1 Index組間分布情況。

2.2 宏基因組分析

與對照組相比，復發組檢測到更多的微生物種類，無論是在屬水平，還是在種水平。屬水平：與對照組相比，復發人群中enterococcus(腸球菌屬)和escherichia(埃希氏菌屬)物種豐度較低，bacteroides(擬桿菌屬)、roseburia、blautia(布勞特氏菌屬)、clostridium(梭菌屬)和ruminococcus(瘤胃球菌屬)物種豐度較高(圖2A)。種水平：與對照組相比，復發人群中enterococcus faecium(屎腸球菌)和bifidobacterium animails(動物雙歧桿菌)豐度下調，bacteroides vulgatus(普通擬桿菌)、roseburia intestinalis(腸道薔薇菌)、bacteroides xylanisolvens(木桿菌)豐度上調(圖2B)。此外，圖2中也展示了GVHD組微生物構成的情況，由于GVHD組例數太少，沒有進行進一步分析。

A：屬水平；B：種水平；CK:對照組；FF:復發組。

2.3 生物信息學分析

與對照組相比，復發組乳糖、半乳糖及蔗糖降解通路下調，丙酮酸代謝為異丁醇的通路、U乙酰胞壁酰基丙氨酸酰及淀粉降解通路上調；GO分析中，復發組細胞膜成分增加，ATP結合、序列特異的DNA結合模塊表達增加；KEGG和Pfam分析中，復發組核糖體亞基L33和S14明顯減少，RNA聚合酶sigma-70因子明顯增加，見圖3～6。

CK:對照組；FF:復發組。

CK:對照組；FF:復發組。

CK:對照組；FF:復發組。

CK:對照組；FF:復發組。

3 討 論

近年來，單倍型造血干細胞移植已經上升為最主要的異基因造血干細胞移植類型，尤其在中國。盡管與同胞全相合移植相比，單倍型移植具有更低的復發率，但移植后復發仍是移植后第一死亡原因。腸道菌群與GVHD、移植后免疫重建、疾病復發的相關性得到了多項研究的證實[9-12]，但當前尚無法明確確切的關系，這與移植后復雜的生理、病理過程有關。PELED等[5]研究證明，eubacterium limosum(黏液真桿菌)的高豐度與異基因造血干細胞移植術后疾病復發、進展之間存在關聯，可能作為潛在的生物標志物或治療靶點來預防移植后復發和提高生存率。GABORIAU-ROUTHIAU 等[13]的實驗發現，分節絲狀桿菌的定植能夠提高Th1細胞產IFN-γ的量、Th17細胞分泌IL-17的量及小腸和結腸固有層淋巴細胞中Treg細胞的量，但單一定植分節絲狀桿菌的小鼠體內Th和Treg細胞的總數量卻比常規小鼠少，提示分節絲狀桿菌盡管存在一定的免疫調節作用，同時也需要其他微生物共同參與才能實現[14-15]。因此，單一微生物變化的影響有限，并不能很好地指導臨床，這也是這個領域研究中存在的主要問題。近期發表在《新英格蘭醫學雜志》上的ECOSPORⅢ期臨床試驗結果首次證實了糞便提取的口服藥物SER-109在臨床上防治復發性艱難梭菌感染的可行性[16]。這樣一種全新的改善腸道微生態的方式完全可能在未來應用于造血干細胞移植后患者，只是安全性有待于進一步探索。

本研究提示了與文獻報道不同的腸道微生物異常，盡管例數偏少，但都說明了移植后腸道菌群的變化與移植后復發存在相關性。這種差異不是單純的一種微生物能夠決定的。本研究結論中發現，動物雙歧桿菌這種有益菌在復發組中豐度下降；同時也發現，屎腸球菌這種有害菌在復發組中豐度下降，普通擬桿菌、腸道薔薇菌、木桿菌這些腸道常駐菌在復發組中豐度增加；進一步分析發現，在復發組中糖酵解相關通路、蛋白質合成代謝上存在一些差異，但由于例數偏少，無法得出有效的生物信息學結論。文獻中關于上述幾種腸道菌群也有一些報道，主要集中在與移植后感染和GVHD的相關性上，未見與移植后復發相關的報道。屎腸球菌，尤其是耐萬古霉素的屎腸球菌在造血干細胞移植術后兒童患者的血流感染中比較常見[17]；普通擬桿菌的豐度與霉酚酸酯的代謝有關，高擬桿菌的患者霉酚酸酯血液濃度更高，潛在降低GVHD的發生率，但可能增加霉酚酸酯相關毒性[18]。

綜上所述，本研究初步發現，在單倍型移植體系下，復發患者的腸道微生態紊亂與文獻報道的不盡相同，傾向于有害菌的增多及營養代謝通路失衡，但限于研究例數，這些差異還有待于更進一步的臨床病例觀察及干預性研究的證實。未來，無論上述差異如何，糾正復發患者的腸道微生態紊亂是全新的一種抗復發策略，而糞便提取的口服藥物可能是一個不錯的選擇。