乙酰基轉移酶抑制劑對食管癌細胞KAT5、Survivin乙?；郊凹毎鲋澈瓦w移的影響*

梁宗英，楊 陽，鄭競雄，趙寶山，侯繼申，孫光蕊△

(1.承德醫學院附屬醫院胸外科，河北承德 067000；2.河北省胸科醫院臨床實驗室，石家莊 050000)

我國食管癌發病率和病死率均占世界范圍內的50%以上，極大地危害了居民健康[1]。雖然手術切除、化療及放療等在一定程度上改善了食管癌患者的預后，但其總體生存率和生活質量仍較差[2]。賴氨酸乙酰化是表觀遺傳學中蛋白質轉錄翻譯后主要修飾方式之一，乙?；揎椇推渌揎椫g的交叉調節對轉錄控制和表觀遺傳程序至關重要。除組蛋白外，許多核蛋白和腫瘤相關蛋白也可以發生賴氨酸乙?；揎棧⒃谀[瘤的發生和發展過程中起到關鍵性作用[3]。研究表明，賴氨酸乙?；揎椥枰阴；D移酶參與完成，KAT5作為一種經典乙?；D移酶通過調控組蛋白和非組蛋白的乙?；揎梾⑴c多種腫瘤的發生和轉移[4]，但其在食管癌中相關蛋白乙?；揎椫械淖饔蒙袩o研究報道。Survivin是細胞內凋亡抑制家族中抗凋亡能力最強的蛋白之一，在多種腫瘤中呈高表達，參與了腫瘤的增殖、凋亡、侵襲及轉移[5]。前期研究顯示，Survivin在食管癌組織及轉移淋巴結中呈高表達并發生了乙酰化，且其高乙?；脚c食管癌分期、組織分化及淋巴結轉移相關[6]。然而，Survivin乙酰化促進食管癌發生及發展的具體機制尚不清楚。本研究觀察乙?；D移酶抑制劑NU9056對食管癌細胞乙酰基轉移酶KAT5、Survivin乙?；郊凹毎鲋?、侵襲及遷移的影響，探討KAT5與Survivin乙?；揎椏赡艽嬖诘膬仍诼撓导霸谑彻馨┌l生和發展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管癌EC109細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)；F12培養基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液、Matrigel基質膠(廣州銳博生物科技有限公司)；SDS-PAGE蛋白凝膠電泳試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、細胞裂解液、MTT(北京碧云天生物科技有限公司)；KAT5、Survivin、乙?；嚢彼酇cetylatedLysine、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、癌基因-Myc(c-Myc)、B淋巴細胞瘤-2(BCL2)和血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體(英國 Abcam公司或美國CST公司)；A/G瓊脂糖珠(上海一基實業有限公司)；DMSO和NU9056(上海斯百全化學有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和分組

取凍存的人食管癌EC109細胞，37 ℃水浴速溶，微量移液槍轉入離心管內并加5 mL含10% F12培養基輕輕吸打混勻，常溫離心；棄上清液，加7～10 mL F12培養基吸打混勻后轉入培養瓶；37 ℃、5% CO2孵箱培養，24 h后換液并觀察細胞生長情況，待細胞鋪滿培養瓶底部約95%進行相關實驗。NU9056處理食管癌EC109細胞為實驗組(NU9056組)，DMSO處理食管癌EC109細胞為對照組(DMSO組)。用胰蛋白酶消化對數生長期EC109細胞，以每孔5×103個細胞/100 μL的密度接種于96孔板，待細胞貼壁后加藥處理，NU9056按照濃度梯度0、0.1、0.5、1.0、5.0 μmol/L處理，每組3個平行孔。細胞處理24 h后進行MTT檢測。每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培養箱孵育4 h后終止培養，棄上清液，加入100 μL DMSO 10 min后，酶標儀檢測570 nm處吸光度(A)值計算細胞增殖抑制率。計算藥物對細胞生長的半數抑制濃度(IC50)，后續實驗均以NU9056 IC50值為細胞給藥濃度。

1.2.2RT-qPCR

RNA提取試劑盒提取總RNA，取300 ng RNA，應用PrimeScriptTMRT Reagent kit，按說明書進行反轉錄為cDNA。應用SYBR Green qPCR Master熒光定量試劑盒檢測mRNA表達。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(30個循環)。溶解曲線參照儀器自動程序。使用U6和GAPDH作為內參，相對表達量以2-ΔΔCt計算。

1.2.3Western blot

提取細胞總蛋白，測定濃度；制備電泳蛋白上樣液，行凝膠電泳。電泳后，轉膜。加一抗4 ℃過夜。次日孵育二抗，重復洗膜后顯影。采用Image proplus軟件分析蛋白條帶的積分光密度(IOD值)。

1.2.4免疫共沉淀實驗

提取細胞總蛋白，測定濃度。加入目的蛋白純抗體5 μL和A/G瓊脂糖珠5 mL,混勻后2×裂解緩沖液補充至總體積450 μL，12 000 r/min離心3 min后，取上清液400 μL置入離心管，4 ℃ 15 r/min,共沉淀12 h。4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清液。1×裂解緩沖液500 μL洗滌A/G瓊脂糖珠。12 000 r/min離心3 min,棄上清液。重復洗滌3次。最后一次洗滌完畢后，棄去上清液。1×裂解緩沖液35 μL和等體積的2×SDS上樣緩沖液混合，煮沸后離心；行Western blot。

1.2.5MTT

取處于對數生長期的細胞，消化后離心收集細胞沉淀。以F12培養基重懸，制成單細胞懸液。細胞計數后，以每孔8×103個細胞接種于96孔板，每孔加入100 μL。常規培養至每孔細胞密度達到80%進行轉染。12、24、48、72 h后，每個時間點拿出一塊板，每孔加入5 mg/mL MTT液30 μL，繼續常規孵育4 h。離心，棄上清液。每孔加入DMSO 150 μL，水平搖床80 r/min 5～10 min。酶標儀檢測每孔的570 nm處A值，繪制細胞生長曲線。

1.2.6劃痕修復實驗

收集細胞，10%胎牛血清的F12培養基配成單細胞懸液；以每孔8×103個細胞接種到96孔板，每孔100 μL。常規培養，待細胞鋪滿孔底，用10 μL無菌移液槍頭垂直板面劃痕，用無血清的培養基將掉下來的細胞洗去。每孔加入2 mL無血清的培養基繼續培養48 h，倒置顯微鏡測量劃痕的寬度。

1.2.7Transwell小室實驗

取轉染后鋪滿孔底細胞，用0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化為單細胞懸液，收集后計數細胞。將Transwell小室按順序放入24孔板，無菌鑷子取出小室，室外加入含15%血清F12培養基600 μL。小室內加入200 μL細胞懸液(細胞數2×104個)，培養液為不含血清的F12培養基，每組細胞重復6個標本。24孔板放入CO2孵育箱內常規培養48 h。取出小室，PBS緩沖液淋洗3次，用棉簽擦去微孔膜內層細胞。4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min。PBS緩沖液涮洗3次，每次更換液體；棉簽擦干液體，顯微鏡下計數穿膜細胞數；每個小室隨機計數10個視野。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 NU9056對食管癌EC109細胞活力的影響

NU9056可濃度依賴性抑制食管癌EC109細胞增殖活力，差異有統計學意義(P<0.05)；經計算IC50=0.946 μmol/ L，本研究選取0.9 μmol/L為 NU9056的終濃度，見圖 1。

圖1 不同濃度NU9056對食管癌EC109細胞抑制作用

2.2 NU9056對KAT5 mRNA和蛋白表達的影響

NU9056組KAT5 mRNA表達(0.12±0.02)明顯低于DMSO 組(1.42±0.06)，差異有統計學意義(P<0.05)。NU9056組KAT5蛋白表達(9.27±0.08)明顯低于DMSO 組(75.67±1.34)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 NU9056對食管癌EC109細胞KAT5 mRNA和蛋白表達的影響

2.3 NU9056對Survivin乙酰化水平的影響

NU9056組中Survivin乙?；蕿?24.74±1.36)%低于DMSO組(76.15±2.04)%，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 NU9056對腫瘤增殖相關蛋白表達的影響

NU9056組中VEGF、BCL2、c-Myc和Cyclin D1蛋白表達水平分別為7.34±0.24、8.75±0.14、10.24±0.17和21.75±0.85，而DMSO組各蛋白的表達水平分別為67.84±1.12、60.72±1.34、70.38±2.04和72.34±1.71，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 NU9056對食管癌增殖相關蛋白表達的影響

2.5 NU9056對食管癌EC109細胞增殖能力的影響

鋪板培養48 h后NU9056組和DMSO組的A值分別為0.48±0.04和0.65±0.05，差異有統計學意義(P<0.05)；鋪板72 h后NU9056組和DMSO組的A值分別為0.56±0.03和0.78±0.05，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 NU9056對食管癌EC109細胞存活能力的影響

2.6 NU9056對食管癌EC109細胞侵襲能力的影響

NU9056組穿膜細胞數(76.32±1.58)個低于DMSO組(127.32±2.46)個，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 NU9056對食管癌EC109細胞侵襲能力的影響(×400)

2.7 NU9056對食管癌EC109細胞遷移能力的影響

鋪板培養48 h后NU9056組細胞劃痕間距(356.42±2.56)μm低于DMSO組(64.54±1.38)μm，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 NU9056對食管癌EC109細胞遷移能力的影響(×400)

3 討 論

食管癌是臨床上常見的上消化道惡性腫瘤。流行病學調查結果顯示，近年來我國食管癌發病率雖有所下降，但總體病死率仍居高不下，嚴重威脅居民健康[7]。侵襲轉移是導致癌癥患者高病死率的主要原因，其中癌基因活化與抑癌基因失活是導致臨床治療失敗的關鍵因素[8]。因此，有效抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移對降低食管癌復發率并提升遠期生存率至關重要。

乙?；揎検潜碛^遺傳學中較常見的一種組蛋白修飾方式，參與多種腫瘤的發生和發展。既往研究多關注于組蛋白的乙?；揎椩谀[瘤中的作用機制，而近年研究發現多種非組蛋白也可以發生乙?；揎?，且與腫瘤的發生和發展密切相關[9]。Survivin基因是一種存在于多種惡性腫瘤及胚胎組織中的獨特分子標記物[10]。大多數惡性腫瘤中Survivin呈過表達狀態，可抑制腫瘤細胞的凋亡、促進腫瘤細胞增殖分化和腫瘤血管生成[11]。多項研究發現，Survivin可以抑制癌細胞的凋亡，導致腫瘤異常增殖，且與腫瘤的不良預后、侵襲轉移行為、耐藥和腫瘤復發密切相關[12-13]。課題組前期研究發現，食管癌組織中Survivin發生了乙?；乙阴；脚c食管癌的分期、分化程度及淋巴結轉移具有明顯相關性[6]。然而，Survivin乙?；c食管癌的發生和發展具體機制尚不清楚。本研究通過體外細胞實驗進一步證實了食管癌EC109細胞內Survivin呈高乙?；癄顟B，說明Survivin作為一種非組蛋白同樣可以發生乙?；揎棧移湟阴；揎椏赡軈⑴c了食管癌的增殖、侵襲和轉移。

蛋白的乙酰化修飾需要在乙?；D移酶的參與下完成，故乙酰基轉移酶在乙?；揎椷^程中起到了至關重要的作用。食管組織中Survivin發生乙酰化同樣需要乙酰基轉移酶的參與，但催化其發生乙?；囊阴；D移酶尚未明確。乙酰轉移酶KAT5屬于MYST家族中的代表性成員，可以催化多種組蛋白和非組蛋白發生乙?；瑫r自身也參與并調控DNA 損傷應答、細胞周期、自噬、腫瘤發生及轉移[14]。前期研究發現，食管癌組織中KAT5呈高表達，與腫瘤分期、分化和淋巴結轉移相關，且其陽性表達與Survivin乙酰化呈正相關[15]。這提示KAT5可能通過自身功能或者靶向調控其他基因的途徑，促進了食管癌發生和發展。KAT5可以通過催化多種組蛋白及非組蛋白發生乙酰化修飾參與癌癥的發生和發展[14]。研究證實，抑制乙酰基轉移酶的表達可以使腫瘤細胞內乙酰化蛋白的乙?；癄顟B發生改變[16]。理論上，通過抑制乙酰基轉移酶的表達會改變食管癌組織中Survivin乙?；揎棤顟B，進而改變食管癌的生物學行為。在沉默或下調乙?；D移酶促進相關蛋白發生去乙酰化作用機制中，沉默KAT5有可能發揮更高的去乙?；淖饔谩５谑彻馨┲?，KAT5作為乙?；D移酶是否參與Survivin乙酰化修飾的關系尚不明確。

本研究以食管癌EC109細胞為研究對象，通過應用乙?；D移酶抑制劑NU9056對食管癌細胞進行處置，通過MTT實驗檢測證實，NU9056可濃度依賴性抑制食管癌EC109細胞增殖活力。乙酰基轉移酶抑制劑在體內可以抑制多種乙?；D移酶的活性，但其往往具有針對性的主要抑制一種乙?；D移酶的活性和表達。本研究結果顯示，NU9056可以明顯抑制KAT5 mRNA和蛋白表達。說明乙?；D移酶抑制劑NU9056可以有針對性地抑制KAT5的活性和表達，是乙酰基轉移酶KAT5的特異性抑制劑。進一步通過免疫共沉淀實驗檢測Survivin乙?；?，結果顯示KAT5表達下調后，食管癌細胞內Survivin乙酰化率明顯降低，提示KAT5作為乙?；D移酶催化了非組蛋白Survivin的乙酰化修飾，可能是調控Survivin發生乙酰化進而改變食管癌生物學功能的一個重要上游分子。

腫瘤的異常增殖、凋亡、侵襲和轉移在惡性腫瘤的發生和發展過程中具有重要作用，抑制腫瘤增殖，誘導腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的重要手段。本研究結果顯示實驗組細胞的增殖受到了明顯的抑制，細胞的愈合遷移距離縮短，穿過濾膜的細胞數量明顯減少。提示NU9056抑制乙酰基轉移酶KAT5的表達使Survivin發生去乙?；?，抑制了EC109細胞的增殖活力，延緩了細胞愈合遷移能力，且侵襲能力受到了明顯抑制。腫瘤的異常增殖是腫瘤侵襲和轉移的基礎，腫瘤增殖過程中起到關鍵作用的基因分子主要包括腫瘤增殖相關蛋白Cyclin D1、c-Myc、BCL2和VEGF，也是預測腫瘤異常增殖的重要標志。研究表明，腫瘤細胞在異常增殖過程中Cyclin D1、c-Myc、BCL2和VEGF均呈表達上調狀態。本研究通過Western blot檢測4種蛋白表達證實，NU9056干預后的食管癌細胞中Cyclin D1、c-Myc、BCL2和VEGF蛋白表達均明顯降低。筆者推測，NU9056干預食管癌EC109細胞后抑制了乙?；D移酶KAT5的活性，使其催化的Survivin蛋白發生去乙酰化進而改變了Cyclin D1、c-Myc、BCL2和VEGF的表達。提示抑制KAT5表達可以降低Survivin乙酰化水平，抑制了細胞增殖通路，進而抑制了食管癌EC109細胞的增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，乙?；D移酶抑制劑NU9056可通過下調乙?；D移酶KAT5靶向調控Survivin乙酰化修飾，進一步通過調控腫瘤增殖過程中起到關鍵作用的基因，進而抑制食管癌EC109細胞的增殖、侵襲和遷移能力，為食管癌的臨床治療提供了新的思路和作用靶點。