lncRNA RP11-635L1.2在膀胱癌組織中的表達及對膀胱癌細胞增殖和侵襲的影響

魯奕君，陳鴻凱，蔡 亮，呂 強，何 毅

膀胱癌是全球范圍內最常見的泌尿系統惡性腫瘤，男性發病率明顯高于女性[1]。隨著診療水平的發展，膀胱癌患者的預后有所改善，由于膀胱癌的高復發率和侵襲性，多數膀胱癌患者的臨床治療效果較差[2]。探究膀胱癌惡性增殖和轉移的調控因子，對提高膀胱癌患者5年生存率具有重要臨床意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一組大于200個堿基長度的內源性RNA分子，缺乏開放閱讀框，不具有編碼蛋白的能力[3]。近年來研究顯示，lncRNA在轉錄和轉錄后可調節靶基因的表達，影響細胞的生理和病理過程[4]。大量研究顯示，膀胱癌中存在多種lncRNA的異常表達，與膀胱癌細胞的活力、侵襲性、血管形成等過程相關，lncRNA可能成為膀胱癌發生和轉移的分子診斷標志物[5-7]。RP11-635L1.2由748個堿基組成，定位于4號染色體。RP11-635L1.2在膀胱癌發病過程中的分子機制研究很少。本研究通過分析RP11-635L1.2在膀胱癌組織和細胞系中的表達水平，探究RP11-635L1.2對膀胱癌細胞生物學行為的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞系和試劑 膀胱癌細胞系MGH-U3、253J、J82、T24和永生化膀胱上皮細胞SV-HUC-1購于中國科學院上海細胞庫；RPMI-1640培養基、DMEM培養基、CCK-8試劑盒、基質膠購于日本Takara公司；Lipofectamine 2000和胎牛血清購于美國Invitrogen公司；空載質粒(pcDNA3-NC)和RP11-635L1.2過表達質粒(pcDNA3-RP11-635L1.2)、qRT-PCR試劑盒購于上海吉瑪制藥技術有限公司；miR-NC和miR-373-3p mimics購于廣州銳博生物科技有限公司；Transwell小室、雙熒光報告載體野生型RP11-635L1.2和突變型RP11-635L1.2購于美國Promega公司；p-EGFR、p-AKT、p-ERK、p-JAK2、p-STAT3、α-Tubulin抗體購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2生物信息學技術分析 登錄GEPIA數據庫分析RP11-635L1.2在膀胱癌組織和癌旁正常組織中的表達水平，登錄LncCeRBase數據庫分析比較與RP11-635L1.2存在高度保守互補序列的微小RNA(miRNA)。

1.3細胞培養與轉染 所有細胞置于37 ℃和5% CO2培養箱中，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養MGH-U3、J82、T24細胞，使用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養253J和SV-HUC-1細胞。選取J82細胞對RP11-635L1.2進行功能性研究，分為NC組和RP11-635L1.2組，根據Lipofectamine 2000試劑盒說明書分別轉染pcDNA3-NC質粒和pcDNA3-RP11-635L1.2質粒。

1.4qRT-PCR檢測RP11-635L1.2和miR-373-3p的相對表達水平 采用Trizol法提取各細胞及轉染后的2組J82細胞總RNA，進一步逆轉錄為cDNA。RP11-635L1.2表達水平以GAPDH為內參，miR-373-3p表達水平以U6為內參。設計引物序列，GAPDH上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'；RP11-635L1.2上游引物：5'-CTCTCTCCAAGTCCCAGTCG-3'，下游引物：5'-TAGGAAGTTGGCAGGGAAGA-3'；miR-373-3p上游引物：5'-GAAGTGCTTCGATTTTGCC-3'，下游引物：5'-GAATACCTCGGACCCTGC-3'；U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。設置qRT-PCR反應條件：92 ℃ 40 s,58 ℃ 28 s,72 ℃ 28 s,循環36次，以2-ΔΔCt法計算RP11-635L1.2和miR-373-3p的相對表達水平。

1.5CCK-8法檢測J82細胞增殖能力 將2組J82細胞以2×103個/孔的密度均勻接種在96孔板中，培養12 h至細胞貼壁。以細胞貼壁為0 d，分別于1、2、3、4、5 d的同一時刻更換新鮮培養基，在每孔中加入CCK-8試劑30 μl，震蕩均勻。37 ℃避光環境孵育240 min，調整酶標儀波長為450 nm，檢測每孔J82細胞的吸光度(A)值。

1.6Transwell實驗檢測J82細胞侵襲能力 2組J82細胞轉染48 h后，采用磷酸鹽緩沖液清洗4次，胰蛋白酶消化，細胞計數板計數。在Transwell上層小室鋪一層基質膠，于培養箱中凝固。2組細胞按照2×104個/孔密度加至Transwell上層小室，在Transwell下層加入含30%血清的RPMI-1640培養基溶液700 μl，于培養箱中培養28 h。采用多聚甲醛凝固、結晶紫溶液染色，流水沖洗后室溫晾干，在倒置顯微鏡下計數。

1.7雙熒光素酶報告實驗 選取對數生長期的J82細胞進行雙熒光素酶報告實驗，分別提取雙熒光報告載體野生型RP11-635L1.2質粒和突變型RP11-635L1.2質粒，分別與miR-NC或miR-373-3p共轉染至J82細胞。培養箱中轉染52 h后，低溫裂解細胞，分別測定細胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達強度，其比值即為相對熒光素酶活性。

1.8Western blot實驗 吸去2組細胞培養基，磷酸鹽緩沖液洗4次，每孔加細胞裂解液200 μl，冰浴裂解40 min，離心取上清蛋白。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，以220 mA電流轉膜至聚丙烯酰胺膜，封閉液封閉3.5 h，加入一抗p-EGFR(1∶1000稀釋)、p-ERK(1∶2000稀釋)、p-JAK2(1∶1000稀釋)、α-Tubulin(1∶5000稀釋)、p-AKT(1∶2000稀釋)、p-STAT3(1∶1000稀釋)，孵育12 h。室溫下與羊抗鼠二抗(1∶5000稀釋)孵育3.5 h。加入化學顯影液反應30 s，在凝膠成像儀中成像。

2 結果

2.1RP11-635L1.2在膀胱癌組織中的表達 與癌旁正常組織比較，膀胱癌組織中RP11-635L1.2的表達明顯降低(P<0.01)，見圖1。

圖1 膀胱癌組織和癌旁正常組織中RP11-635L1.2的表達

2.2RP11-635L1.2在膀胱癌細胞系中的表達 與永生化膀胱上皮細胞SV-HUC-1比較，膀胱癌細胞系MGH-U3、253J、J82、T24中RP11-635L1.2的表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)，其中RP11-635L1.2在J82細胞中的表達水平最低，見圖2。

圖2 膀胱癌細胞系中RP11-635L1.2的表達

2.3轉染后J82細胞中RP11-635L1.2的表達情況 qRT-PCR檢測結果顯示，NC組和RP11-635L1.2組J82細胞中RP11-635L1.2表達水平分別為1.01±0.57和10.48±3.12，與NC組相比，RP11-635L1.2組J82細胞RP11-635L1.2表達水平明顯升高(P<0.01)。

2.4RP11-635L1.2對J82細胞增殖的影響 CCK-8法檢測顯示，相比NC組，RP11-635L1.2組從第2日開始J82細胞增殖能力明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見圖3。

圖3 RP11-635L1.2對膀胱癌J82細胞增殖的影響與NC組比較，①P<0.05，②P<0.01

2.5RP11-635L1.2對J82細胞侵襲能力的影響 Transwell實驗顯示，NC組和RP11-635L1.2組J82細胞侵襲量分別為(60.24±16.47)個和(24.32±11.30)個，與NC組相比，RP11-635L1.2組J82細胞侵襲量明顯減少(P<0.01)。見圖4。

圖4 RP11-635L1.2對膀胱癌J82細胞侵襲能力的影響

2.6RP11-635L1.2對miR-373-3p的靶向作用 利用LncCeRBase數據庫預測，RP11-635L1.2與miR-373-3p存在互補結合的序列，見圖5。雙熒光素酶報告實驗顯示，野生型RP11-635L1.2與miR-373-3p共轉染組熒光素酶活性明顯低于與miR-NC共轉染組(P<0.01)，當RP11-635L1.2與miR-373-3p結合區域突變后，miR-373-3p對細胞的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。見圖6。

圖5 RP11-635L1.2與miR-373-3p存在高度保守互補序列

圖6 雙熒光素酶報告實驗結果

2.7RP11-635L1.2對miR-373-3p表達的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，NC組和RP11-635L1.2組膀胱癌J82細胞miR-373-3p表達水平分別為5.12±1.28和0.99±0.35，過表達RP11-635L1.2抑制了J82細胞miR-373-3p的相對表達(P<0.01)。

2.8RP11-635L1.2對膀胱癌J82細胞EGFR/AKT信號通路蛋白表達的影響 相比NC組，RP11-635L1.2組EGFR/AKT信號通路蛋白p-EGFR、p-AKT、p-ERK、p-JAK2、p-STAT3表達量明顯降低(P<0.01)，見圖7。

圖7 RP11-635L1.2對J82細胞EGFR/AKT信號通路蛋白表達的影響

3 討論

lncRNA的異常表達可顯著影響細胞內癌基因或抑癌基因的表達，改變細胞的增殖活性、侵襲性、凋亡水平等，從而誘導腫瘤的發生[8-10]。目前研究證實，越來越多的lncRNA與膀胱癌發病密切相關[11-12]。LI等[13]研究發現，lncRNA LINC00355在膀胱癌組織中上調，尤其是在TNM分期較差的組織中，其高表達與膀胱癌患者的不良預后相關，沉默lncRNA LINC00355抑制了膀胱癌細胞的遷移、侵襲、上皮間充質轉化過程。SHEN等[14]研究顯示，與正常組織相比，膀胱癌組織中lncRNA MAGI2-AS3表達顯著下調，并且與腫瘤分期和預后不良呈負相關，其過表達可抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲。YANG等[15]報道，lncRNA LINC01133在永生化膀胱上皮細胞外泌體中的表達明顯高于在膀胱癌細胞中的表達，提示含有lncRNA LINC01133的外泌體通過誘導Wnt信號通路失活來抑制腫瘤細胞活力、遷移和侵襲。但在膀胱癌細胞增殖和侵襲過程中RP11-635L1.2的作用尚未明確。

本研究首先通過GEPIA數據庫分析相關數據顯示，RP11-635L1.2在膀胱癌組織中表達下調。在此基礎上本研究通過qRT-PCR檢測顯示，與永生化膀胱上皮細胞相比，RP11-635L1.2在膀胱癌細胞系中表達下調，意味著RP11-635L1.2可能在膀胱癌的發病過程中發揮重要作用。本研究進一步通過體外培養J82細胞并給予RP11-635L1.2過表達質粒，結果表明RP11-635L1.2不僅能夠抑制J82細胞的增殖能力，而且對細胞的侵襲能力表現出拮抗作用。

明確lncRNA的靶基因是探究lncRNA分子機制的重要環節[16]。近年來多項研究表明，lncRNA通過與miRNA 5'端互補配對結合，造成游離miRNA表達顯著降低，從而調節腫瘤細胞的生長和上皮間充質轉化[17-18]。本研究通過LncCeRBase生物數據庫發現，RP11-635L1.2與miR-373-3p存在結合位點。研究顯示，腎透明細胞癌組織中miR-373-3p表達高于相鄰非腫瘤組織，其可促進細胞周期、抑制細胞凋亡和維持線粒體膜電位，起到促腫瘤作用[19]。與體檢健康者相比，食管鱗狀細胞癌患者術前血清miR-373-3p表達水平顯著升高，而且miR-373-3p在癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織，并指出miR-373-3p啟動子甲基化水平在癌組織中顯著降低是miR-373-3p異常高表達的原因[20]。由此可見，miR-373-3p可能是一種致癌基因。WANG等[21]研究顯示，與鄰近正常組織相比，膀胱癌組織中miR-373-3p表達水平升高，而且膀胱癌患者血清miR-373-3p表達水平高于體檢健康者，提示miR-373-3p過表達能夠促進膀胱癌細胞的增殖和侵襲。本研究通過雙熒光素酶報告實驗驗證miR-373-3p與RP11-635L1.2之間存在靶向關系。同時，qRT-PCR檢測發現miR-373-3p表達受RP11-635L1.2的負調控。此外，miR-373-3p可通過活化EGFR/AKT信號通路，促進膀胱癌的發生發展[21]。本研究還顯示，過表達RP11-635L1.2后，EGFR/AKT信號通路蛋白p-EGFR、p-AKT、p-ERK、p-JAK2、p-STAT3表達減少，提示EGFR/AKT信號通路活化程度降低，進一步證實RP11-635L1.2是通過負調控miR-373-3p參與膀胱癌病理發展的。

綜上，RP11-635L1.2在膀胱癌組織和細胞系中低表達，其通過負調控miR-373-3p抑制膀胱癌J82細胞的增殖、侵襲。RP11-635L1.2可能成為膀胱癌新的診斷標志物和治療靶點。