LINC00221通過激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

張玉萍 宋蕾 李春艷 程曉磊 孫國鋒

肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制仍不清楚[1]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)通過表觀遺傳發(fā)揮基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，其異常表達(dá)與癌癥發(fā)展中多種病理過程密切相關(guān)[2]。長間隔非編碼RNA 00221(long intergenic non-coding RNA 00221，LINC00221)是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，其表達(dá)上調(diào)與肌層浸潤性膀胱癌進(jìn)展相關(guān)，增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌的順鉑耐藥性，影響治療和預(yù)后[3]。有學(xué)者通過整合分析發(fā)現(xiàn),LINC00221與HCC病人生存期密切相關(guān)，是HCC的預(yù)后生物標(biāo)志物[4]。本研究探討干擾LINC00221表達(dá)對HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲生物學(xué)行為的影響。

材料與方法

一、試驗(yàn)試劑

肝上皮細(xì)胞LO2和HCC細(xì)胞株HCCLM6、Hep3B、MHCC-97H、Huh-7、MHCC-LM3均由本院實(shí)驗(yàn)中心凍存。干擾片段siRNA-LINC00221和陰性對照siRNA-NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine? 3000購自美國Thermo Fisher公司；RPIM1640培養(yǎng)基、PBS和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；ERK信號(hào)激動(dòng)劑C16-PAF購自美國MCE公司。LINC00221干擾序列1：F：AGAAUCAUAUGCAAACAGCCU；R：GCUGUUUGCAUAUGAUUCUUC。LINC00221干擾序列2：F：AGAAGAAUCAUAUGCAAACAG；R：GUUUGCAUAUGAUUCUUCUAA。

二、方法

1.細(xì)胞處理：向細(xì)胞中加入含有10%胎牛血清及1%雙抗的RPIM1640培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。使用Lipofectamine? 3000分別將siRNA-LINC00221和siRNA-NC轉(zhuǎn)染到MHCC-LM3細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為空白對照組、陰性對照組、LINC00221干擾組(轉(zhuǎn)染siRNA-LINC00221)、LINC00221干擾+ERK激動(dòng)劑組(轉(zhuǎn)染siRNA-LINC00221+C16-PAF)。

2.CCK-8實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染處理的第0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，向細(xì)胞中加入5 μl的CCK-8溶液孵育4小時(shí)，通過酶標(biāo)儀測定450 nm波長下OD值，計(jì)算MHCC-LM3細(xì)胞活力。

3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞長滿后，使用10 μl槍頭向單層細(xì)胞劃線，寬度控制在500 μm左右，顯微鏡拍照并記為0小時(shí)結(jié)果。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后用顯微鏡拍照，計(jì)算MHCC-LM3細(xì)胞24 h內(nèi)劃痕愈合率。

4.Transwell實(shí)驗(yàn)：Transwell小室底部基底膜加入100 μl基質(zhì)膠稀釋液，風(fēng)干后加入100 μl的培養(yǎng)基。……