革蘭氏陽性菌VicRK雙組份信號轉導系統調控功能的研究進展

龍莉，王一然，陳文川，王詩達

(四川大學華西口腔醫學院·口腔疾病研究國家重點實驗室·國家口腔疾病臨床醫學研究中心，四川 成都 610041)

VicRK(也稱WalRK或YycFG)是革蘭氏陽性菌中高度保守的雙組份信號轉導系統(two component system，TCS)之一。VicRK TCS最初在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)中因具有調控細胞分裂的功能得到關注，而后陸續在金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)及變異鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)等致病菌中被發現[1-2]。與其他雙組份系統一樣，VicRK主要由兩個部分組成，位于細胞膜上的組氨酸蛋白激酶VicK和胞內應答因子VicR。蛋白激酶VicK可感受細胞內外刺激發生自磷酸化，此后將磷酸基團傳遞給VicR蛋白。磷酸化的VicR(VicR-P)蛋白發生構象變化后可調控下游靶基因的表達，從而達到調控細胞功能的目的[2]。VicK的磷酸酶活性還可將VicR-P去磷酸化，在細胞功能調控中發揮重要作用[3-4]。作為一個與細胞壁代謝相關的信號調控系統，VicRK TCS在細胞分裂、細胞自溶、環境應激、生物膜形成及毒力因子表達、免疫調控等過程中都發揮著關鍵作用，影響細菌的生存力和致病性。

1 VicRK TCS調控細胞分裂的作用機制

在枯草芽孢桿菌中，vicR和vicK均為細菌生存的必需基因。利用底物啟動誘導型啟動子表達vicRK基因的條件下可成功構建vicRK基因敲除株，使得細胞分裂發生明顯障礙、細胞壁結構產生缺陷，形成空泡結構(可能是細胞自溶的結果)。另一方面，vicR過表達導致枯草芽孢桿菌小細胞形成[5]，與其在金黃色葡萄球菌與肺炎鏈球菌中類似[6-7]。ftsAZ是第一個被證實的受VicRK系統直接調控基因，與細胞分裂緊密相關。FtsZ可在細胞分裂時形成Z環，分隔姊妹細胞，形成細胞隔膜。VicK與FtsZ的相互作用可將VicK定位于細胞隔膜上，同時將VicR定位于擬核，這對于VicK磷酸化VicR、調控細胞分裂至關重要[8]。

肽聚糖骨架構成革蘭氏陽性菌細胞壁的主要成分，因此，肽聚糖的合成與水解是細胞分裂的一個重要環節。在肺炎鏈球菌中，VicRK主要通過PcsB半胱氨酸、組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶(cysteine，histidine-dependent amidohydrolases/peptidases，CHAP)結構域蛋白調控肽聚糖的水解。且CHAP結構域蛋白在金黃色葡萄球菌及變異鏈球菌中也發揮著水解肽聚糖酶、調控細胞分裂的作用[9]。純化的肺炎鏈球菌PcsB蛋白自身不具備水解酶活性，但當FtsXE蛋白與PcsB的相互作用使PcsB蛋白特異性定位于細胞隔膜后獲得水解酶活性。FtsX缺失或PcsB缺失會造成類似細胞壁缺損的細胞表型[9-10]。此外，VicRK的另一個靶基因dacB也參與細胞分裂過程，dacB編碼的L,D-羧肽酶主要參與肽聚糖的成熟，dacB缺失誘導細胞鏈延長和細胞不對稱分裂[11]。

與枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌形相似，在變異鏈球菌中，VicK的缺失也使細胞分裂受阻、形成細胞長鏈[12]。此外，當VicK的磷酸酶受阻時，VicR-P的累積同樣會影響細胞分裂。VicK磷酸酶受阻的變異鏈球菌表現出異常的細胞形態，且發生不對稱分裂現象[4]。

2 VicRK TCS調控細胞自溶的作用機制

細胞自溶是由肽聚糖水解酶對細胞壁進行的自我消化，在細胞壁生物合成途徑(包括細胞分離、肽聚糖重塑及eDNA釋放)中發揮重要作用。自溶素(autolysin，Alt)負責肽聚糖的水解，其主要由氨基葡萄糖苷酶(glucosaminase，GL)和酰胺酶(amidase，AM)結構域組成，并通過兩種細胞外裂解酶參與水解過程[13]。在枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌及格氏鏈球菌等革蘭氏陽性菌中，VicRK TCS都參與了細胞壁水解過程[14]。枯草芽孢桿菌中，LytE、CwlO內肽酶(水解酶的一種)受VicRK直接調控[15]。金黃色葡萄球菌中，CidAB，Gcp對細胞自溶具有正向調節作用。VicRK系統除了通過調控自溶素AltA和AltM來控制細胞壁的代謝過程，還可以調控cidA的表達。下調VicR的表達水平會降低cidA基因的表達，抑制細胞自溶[13，16]。AltS是格氏鏈球菌中主要的自溶素，受到VicRK及LytST的調控。Liu等[17]研究表明，vicR或vicRK的缺失會使細菌對自溶的抵抗增強，而vicK缺失株在自溶方面表現出與野生株相似的生長曲線。此外，在變異鏈球菌及肺炎鏈球菌中，敲除vicK基因可抑制altA的表達，使細胞對自溶具有超抗性[18]。因此，VicRK TCS對革蘭氏陽性菌的正常自溶過程極其重要。

3 VicRK TCS調控細胞環境應激的作用機制

細菌能精確的檢測環境參數(pH、溫度、氧分壓、滲透壓等)并做出適應性改變，這也是其能夠在復雜環境中生存的基礎。VicRK TCS在革蘭氏陽性菌應對環境應激的過程中有著重要的調控作用。在枯草芽孢桿菌中，熱刺激(42 ℃)可提高VicRK的表達水平[19]。Takada等[20]也表明當溫度升高至60 ℃時，VicK的自動磷酸化水平升高[20]。因此，枯草芽孢桿菌的VicRK對溫度變化也會產生一定的適應性改變。變異鏈球菌的耐酸性是其致病性的重要因素之一。將變異鏈球菌置于pH=5.5的酸性環境中，atpE/A、ffh、radA、gcrR等經典的耐酸反應基因的表達水平是在pH=7.5中的兩倍及以上。而VicK缺失的變異鏈球菌無法抵抗pH=5.5的酸性環境，atpE/A、ffh、radA等基因的表達反而呈現下調趨勢[21]。同時，在格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii，S.gordonii)中，vicR或vicRK缺失會影響細菌在酸性條件(pH=5.0)下的生長，但僅缺失vicK時，對細菌生長的影響較小[22]。格氏鏈球菌與變異鏈球菌都是兼性厭氧菌，敲除vicK基因后的變異鏈球菌對氧應激的敏感性增高，但敲除vicK基因后的格氏鏈球菌與野生株表現出類似的表型，只有在vicR或vicRK缺失時，格氏鏈球菌在有氧環境下的生長速度才明顯減慢，且最終的細菌生長量減少至野生株的一半[17，23]。此外，VicRK調控的氧應激與酸耐受可能與精氨酸亞胺酶系統(arginine deiminase system，ADS)相關。vicK基因失活可導致變異鏈球菌對滲透壓敏感性的增加[21]，表明 VicRK TCS也參與調節細胞滲透保護的過程。

4 VicRK TCS調控細胞脂肪酸代謝的作用機制

脂質雙分子層是細菌生物膜的重要組成部分，脂肪酸的代謝影響生物膜的流動性和滲透性。VicRK TCS在多種細菌中參與脂肪酸的代謝。在金黃色葡萄球菌中，等位基因突變株SAM1010(yycF1)對長鏈不飽和脂肪酸的敏感性高于野生株[24]。在枯草芽孢桿菌中，VicRK對膜磷脂去飽和酶具有間接調控作用,可抑制yocE(des) 基因(編碼脂肪酸去飽和酶)的表達[5]。誘導肺炎鏈球菌中的vicR或敲除vicK影響脂肪酸轉錄相關基因的表達，譬如，用麥芽糖在vicK敲除株中誘導vicR過表達時，12個fab基因的表達改變且7個脂肪酸合成基因上調，肺炎鏈球菌膜的直鏈、16和 18碳飽和及不飽和脂肪酸的占比發生變化。純化的非磷酸化VicR蛋白和FabTH-acp操縱子的啟動子體外結合實驗[25]進一步證實VicR可直接抑制FabT阻遏物轉錄，且發揮轉錄調控作用的是非磷酸化狀態的VicR。

5 VicRK TCS調控細胞免疫功能的作用機制

如何對抗宿主的免疫系統也是細菌生存至關重要的一環。在肺炎鏈球菌及化膿性鏈球菌中，VicRK可通過簡化表面蛋白的表達，從而逃避口腔黏膜和唾液腺的上皮、口腔液和淋巴組織的樹突細胞、巨噬細胞和多形核白細胞(polymorphonucleocyte，PMN)等宿主免疫細胞的吞噬作用[26]。在變異鏈球菌中，敲除vicK使得細菌對補體C3b沉積的敏感性降低，與血清免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)的結合率低，進而導致C3b/IgG介導的PMN的調理吞噬作用減弱。在vicK敲除株中，補體推定肽酶的基因(pepO和smu.399)在存在血清的環境下上調，在野生株中，這兩個基因的缺失顯著增強了C3b沉積和調理吞噬的水平。因此，VicRK可能是通過調控肽酶來輔助細菌逃避C3b/IgG介導的PMN調理吞噬作用[27]。

6 VicRK TCS調控細菌致病性的作用機制

生物膜是金黃色葡萄球菌在機體的重要生存模式，其形成與VicRK TCS密切相關。金黃色葡萄球菌形成的生物膜阻礙藥物擴散是導致細菌在宿主體內大量繁殖從而引起慢性感染的重要原因。Wu等[28]指出，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)的生物膜量約為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)生物膜量的50%且胞外聚合物的量明顯少于后者，生物膜中存在不少“空白”區域[28]。非編碼反義核糖核酸(antisense ribonucleic acid，asRNA)可通過堿基配對與目標信使RNA(messenger RNA，mRNA)結合，形成RNA雙鏈體結構，進而抑制相應mRNA的轉錄或翻譯并執行調節功能。過表達antisense vicR RNA抑制vicR mRNA的轉錄使金黃色葡萄球菌的生物膜形成減少，致病性下降[29]。表皮葡萄球菌及血鏈球菌作為人體的機會致病菌，生物膜在其致病性方面也發揮著重要作用。表皮葡萄球菌asRNA降低vicR的表達可促使生物膜的量以及胞外聚合物明顯下降[30-31]；敲除vicK基因的血鏈球菌生物膜也下調，可能與生物膜中eDNA的較少有關[32]。

變異鏈球菌與齲病發生發展密切相關，產酸、耐酸、通過生物膜形式在牙體硬組織表面牢固的黏附力構成其致齲性的三大要素。葡聚糖是變異鏈球菌生物膜細胞外基質的主要成分，可分為胞內多糖和胞外多糖。變異鏈球菌通過葡糖基轉移酶(由gtfB、gtfC、gtfD基因編碼)合成葡聚糖聚合物[33]。其中GtfB主要合成α-1,3糖苷鍵的水不溶性葡聚糖，GtfD合成水溶性α-1,6糖苷聚合物，而GtfC可同時合成兩種類型的葡聚糖產物，但水不溶性葡聚糖占比更大[34]。GtfB/C合成的胞外葡聚糖具有很強的粘性，可促進變異鏈球菌在牙面的附著，從而促進生物膜的形成。基因芯片及體外啟動子結合分析[35]表明，VicR可直接結合到gtfB/C的啟動子區域，對其轉錄進行直接調控。敲除vicK基因時，gtfB/D的表達明顯下調，而gtfC未發現明顯變化。相對于野生菌株，突變株形成的生物膜粗糙，呈塊狀，容易破裂且松散。而過表達vicRK時，gtfB/C/D以及gbpB(葡聚糖結合蛋白)的表達都上調，形成的生物膜雖然較為粗糙，但是相對致密[34]。VicK的磷酸酶活性對變異鏈球菌的致病性也有重要作用。當通過關鍵氨基酸的點突變阻斷VicK的磷酸酶活性時，gtfB/C以及gbpB明顯下調，而gftD上調，形成的生物膜同樣疏松易被破壞[4]。過表達變異鏈球菌中antisense vicR RNA抑制VicR mRNA的轉錄，細胞生物膜量明顯下降且細胞外基質形成減少[36-38]。既往研究[39]還發現，患齲兒童口腔內提取的變異鏈球菌antisense vicR RNA表達水平低于未患齲兒童，表明過表達antisense vicR RNA的變異鏈球菌致齲性降低。vicX與vicRK同屬于一個啟動子基因，作為三反子操縱子，vicX對gtfB/C/D也有調控作用。敲除vicX基因時，gtfB/C明顯上調，且生物膜比野生型更為致密[40]。

此外，VicRK還影響細菌對抗生素的應答。在磷霉素、萬古霉素等抗生素的刺激下，枯草芽孢桿菌VicRK的表達水平提高[19]。耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus，VRSA)的產生也和VicRK存在密切關系， YycHI可調節金黃色葡萄球菌YycGF(VicRK)蛋白，YycHI的突變誘使YycGF(VicRK)活性下調，進而降低了細菌對萬古霉素的敏感性[41]。

7 結語

VicRK TCS影響細胞分裂、細胞自溶、環境應激、脂肪酸合成、免疫調控、生物膜形成等，對革蘭氏陽性菌的生存和致病性至關重要。因此，VicRK蛋白有望成為抑制致病菌的重要靶點之一。抑制VicK的激酶活性或磷酸酶活性、誘導過表達antisense vicR RNA等抑菌方式被相繼提出，為MRSA引起的頑固骨髓炎、肺炎鏈球菌引起的肺炎及變異鏈球菌引起口腔齲病等疾病的防治提供了新思路。