OX40/OX40L共刺激信號分子在慢性乙肝病毒感染者外周血中的表達研究*

竇 芊 李 贏 王園園 楊 瑞

新鄉醫學院第三附屬醫院感染科，河南省新鄉市 453000

乙型肝炎病毒(HBV)是誘發肝癌、肝硬化及慢性乙肝的主要因素，雖然不會破壞細胞，但嚴重影響患者的身體健康[1]。目前全球慢性乙肝患者約2.4億人，每年致死率約為0.27%，且發病率不斷上升[2]。HBV感染后，免疫應答的類型和強度影響疾病的轉歸和進展，T淋巴細胞是清除HBV的主力軍[3]。共刺激分子通過調節免疫細胞，在一定程度上可以影響免疫疾病的發展，進一步提高機體免疫功能[4]。OX40共刺激分子與免疫、炎性疾病密切相關，主要表達于活化的T細胞表面[5]。成熟的T細胞包括兩種，其中，表達的OX40存在CD4+T細胞表面，巨噬細胞、B細胞、單核細胞存在表達的配體OX40L[6]。OX40/OX40L分子在CD4+T細胞的分化、產生、增殖及遷移中發揮著重要的作用，可調節固有免疫、體液免疫和細胞免疫，進而促進產生自身抗體和B細胞成熟[7-8]。但有關于OX40/OX40L分子在慢性乙肝患者中的表達研究甚少。本研究通過流式細胞儀檢測OX40/OX40L表達水平，探討其在慢性乙肝感染者外周血中的表達及意義，旨在指導臨床。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年6月—2020年6月本院收治的慢性HBV感染患者82例為觀察組，其中男46例，女36例，年齡31～67歲，平均年齡(53.67±1.73)歲；病程2～11年，平均病程(6.31±1.29)年。根據感染的不同時期，將觀察組的感染患者分為4個不同亞組，包括免疫耐受組23例，免疫清除組20例，低復制組22例，再活動組17例。同期選取健康體檢者80例為對照組，其中男43例，女37例，年齡30～69歲，平均年齡(54.61±1.59)歲。觀察組和對照組年齡、性別、病程比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 選擇標準 納入標準：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準[9]；(2)無藥物性肝病；(3)無遺傳性肝病；(4)患者及家屬知情并同意，且經醫院倫理委員會批準。排除標準：(1)糖尿病、嚴重器質性病變、腫瘤、自身免疫性疾患等；(2)急性乙型肝炎；(3)酒精性肝病；(4)合并免疫缺陷病毒、丁型肝炎、丙型肝炎等。

1.3 不同亞組分組標準 參照2015版《慢性乙型肝炎防治指南》[9]，根據入選患者的組織學、病毒學、生化學檢測結果、臨床癥狀體征、病史分為4個亞組：(1)免疫耐受組：ALT正常，血清HBeAg陽性，肝組織學無或輕微肝纖維化、無明顯異常或輕度炎癥，血清HBV-DNA水平高(>200 000IU/ml)；(2)免疫清除組：ALT持續或間歇升高，血清HBeAg陽性，血清HBeAg陽性，肝纖維化快速發展，甚至形成肝衰竭和肝硬化、肝組織學中度或嚴重炎癥壞死，血清HBV-DNA水平>2 000IU/ml；(3)低復制組：ALT正常，血清HBeAg陰性，肝組織學無明顯異常或輕度炎癥，血清HBV-DNA水平低(<1 000IU/ml)；(4)再活動組：ALT持續或反復異常，血清HBeAg陰性，伴有肝臟炎癥壞死，血清HBV-DNA水平高。

1.4 方法

1.4.1 T淋巴細胞共刺激分子檢測[5]：清晨空腹取靜脈血5ml，抗凝處理后準備4支試管，每支試管中200μl的抗凝全血，其中1支試管加入IgG-PE、IgG-FITC及IgG-APC當做對照，另外3支試管分別加入CD8+、CD4+、CD3+流式抗體。震蕩混合均勻后常溫避光保存0.5h，加溶血劑，0.5h后離心沉淀加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，混勻使用流式細胞儀檢測。

1.4.2 外周血OX40/OX40L的表達檢測[10]：采集外周血2ml，設置IgG對照，分別加入OX40-PE、OX40L-PE、CD4-FITC、CD8-FITC、CD14-FITC、CD19-FITC，低溫避光0.5h后加入PBS離心，取沉淀加PBS，使用流式細胞儀，記錄表達數據。

1.4.3 肝功能指標檢測[11]：取靜脈血5ml，放置于EDTA管中，使用生化分析儀得出白蛋白/球蛋白(A/G)、總膽紅素(TBIL)、谷丙轉氨酶(ALT)等肝功能指標。

1.5 觀察指標 (1)記錄兩組患者T細胞亞群CD4+、CD8+、CD3+比例及CD4+/CD8+水平；(2)記錄患者外周血OX40/OX40L的表達情況；(3)不同亞組肝功能相關指標，包括A/G水平、ALT、TBIL；(4)肝功能與OX40/OX40L表達水平的相關性分析。

2 結果

2.1 觀察組和對照組T細胞亞群比較 觀察組外周血T細胞亞群CD4+/CD8+、CD4+、CD3+較對照組低，CD8+較對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 觀察組和對照組T細胞亞群比較

2.2 觀察組和對照組外周血OX40/OX40L表達水平比較 兩組外周血CD8+T細胞表面OX40表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；觀察組外周血CD4+、CD14+、CD19+T細胞表面的OX40/OX40L較對照組表達水平高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 觀察組和對照組外周血OX40/OX40L表達水平比較

2.3 不同亞組OX40，OX40L水平比較 4個亞組外周血CD4+T細胞表面的OX40表達水平比較，再活動組最高，其次是免疫清除組、低復制組，免疫耐受組最低(P<0.05)；4個亞組CD14+、CD19+T細胞表面的OX40L表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同亞組HBV患者周血OX40/OX40L表達及肝功能比較

2.4 不同亞組肝功能相關指標比較 免疫耐受組、免疫清除組、低復制組、再活動組的肝功能指標A/G水平依次降低，ALT、TBIL水平依次升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同亞組肝功能相關指標比較

2.5 肝功能與OX40/OX40L表達水平相關性分析 OX40/OX40L表達水平與肝功能指標ALT、A/G呈正相關(P<0.05)，與TBIL無相關性(P>0.05)。見表5。

表5 肝功能指標與OX40/OX40L表達水平相關性分析

3 討論

HBV感染機體后復制主要場所在肝臟，發生多種免疫應答反應，發揮T細胞的溶解、殺傷作用，使肝細胞凋亡同時清除病毒[12]。機體免疫系統正常的情況下，清除病毒最有效、速度最高且避免肝細胞受損。若機體免疫系統異常，短時間內無法徹底清除病毒，導致HBV在體內持續復制，最終造成慢性乙肝[13]。慢性乙肝與病毒免疫逃逸、免疫功能異常、免疫耐受等密切相關，主要在于T細胞凋亡，導致清除病毒的不徹底性，進一步造成乙肝慢性化[14]。CD4+細胞發揮刺激細胞/體液免疫的效果，CD8+細胞可清除HBV和損傷肝細胞，CD4+/CD8+可反映機體免疫狀態。本研究中，HBV感染患者外周血T細胞亞群CD4+/CD8+、CD4+、CD3+較健康人更低，CD8+較健康人更高，提示患者免疫狀態較健康人較差。同謝麗平等[3]研究結果一致，T細胞與抗原之間特異性應答，降低HBV復制水平，抑制乙肝病理發展。

T細胞的第二刺激信號由共刺激分子給予，信號增強/缺失引起免疫疾病或者免疫耐受，而OX40/OX40L分子在T細胞的活化方面具有一定的促進作用[15]。由于炎癥因子的刺激，外周血中的OX40和OX40L結合，免疫細胞相互作用，延長其mRNA半衰期，進一步持續活化T細胞[16]。骨髓細胞借助于OX40/OX40L途徑向肝內聚集，加快T細胞增殖，提高機體免疫功能。本研究結果顯示，觀察組外周血CD4+、CD14+、CD19+T細胞表面的OX40/OX40L較對照組表達水平更高，提示HBV感染者外周血OX40/OX40L表達水平高于健康機體。有研究[11]發現，冠狀動脈和腎炎型患者外周血OX40/OX40L較健康機體表達水平升高，本研究結果與之一致。

OX40/OX40L在多種疾病中表達增高，二者相輔相成，促進T細胞轉化為Th2，共同維持免疫應答的有序進行。此外，4個亞組外周血CD4+T細胞表面的OX40表達水平比較，再活動組最高，其次是免疫清除組、低復制組，免疫耐受組最低，提示再活動組外周血OX40表達水平最高，表明疾病活動性與外周血OX40表達水平具有相關性。在慢性乙肝免疫應答過程中，可能造成機體肝組織損傷。陳娟等[17]研究表明，外周血共刺激分子表達與肝功能存在相關性。本研究結果顯示，免疫耐受組、免疫清除組、低復制組、再活動組的肝功能指標A/G水平依次降低，ALT、TBIL水平依次升高，提示HBV活動性越低，肝功能指標水平越正常，相關性分析顯示，OX40/OX40L表達水平與肝功能指標ALT、A/G呈正相關，提示OX40/OX40L表達水平可反映患者肝功能受損水平。

綜上所述，慢性乙肝患者外周血OX40/OX40L分子表達水平與病例發展階段、肝功能指標具有相關性，活動性越高，表達水平越高，肝功能受損越嚴重。借助于檢測OX40/OX40L表達水平，可在一定程度上反映患者免疫功能。