小鼠脊髓源原代星形膠質細胞與小膠質細胞的同步培養及鑒定*

吳雪， 黃彩云， 袁佳鈺， 付雅芬， 馬佳雪， 楊潔， 張前,**

(1.陜西中醫藥大學 藥學院， 陜西 咸陽 712000； 2.陜西師范大學 生命科學學院， 陜西 西安 710000)

膠質細胞約占哺乳動物中樞神經系統細胞總量的90%，在維持中樞神經系統內環境穩態方面具有不可替代的作用。膠質細胞主要包括大膠質細胞(星形膠質細胞、少突膠質細胞)和小膠質細胞，其中小膠質細胞與星形膠質細胞在調節中樞神經炎癥反應過程中尤為關鍵，二者在炎癥損傷機制中所扮演的角色正成為中樞神經系統疾病研究領域的熱點。目前文獻中獲取這兩種細胞的組織材料主要來源于動物大腦[1-4]，以昆明胎鼠脊髓作為組織材料的文獻未見報道。膠質細胞培養周期長，一般需要9～14 d才能達到較高的匯合度。現有報道中，獲得高純度的星形膠質細胞和小膠質細胞的方法各異，效率不一，步驟較復雜。本研究采用孕晚期昆明胎鼠的脊髓作為組織來源，采用機械吹打結合自然沉降獲得混合膠質細胞、搖床振搖結合傳代進行分離純化，可以在較短的時間內(6～9 d)獲得高純度的星形膠質細胞和小膠質細胞，操作簡便、重復性好，為后期研究與星形膠質細胞、小膠質細胞相關的脊髓源疾病提供了良好的實驗材料，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物 昆明小鼠(孕晚期)購自西安交通大學實驗動物中心。

1.1.2主要試劑 高糖伯克改良伊格爾培養基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM)、0.25% 胰蛋白酶[含0.038% 乙二胺四乙酸(EDTA)]、青霉素(100 000 U/L)、杜式磷酸鹽緩沖液(dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS)、Dylight 488二抗、4%多聚甲醛溶液均購自博士德公司(中國，武漢)，多聚賴氨酸(Poly-L-lysine, PLL)購自Sigma公司(美國，圣路易斯)，Triton X-10購自Amresco公司(美國，華盛頓)，二脒基苯基吲哚(DAPI)購自巴傲得公司(中國，南京)。

1.1.3主要儀器 光學顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、解剖顯微鏡均購自徠卡公司(德國，維茨拉爾)，CO2培養箱購自默賽飛世爾科技有限公司(中國，上海)，水浴恒溫搖床購自一恒科學儀器有限公司(中國，上海)。

1.2 實驗方法

1.2.1混合膠質細胞培養 孕晚期昆明小鼠麻醉后脫頸處死，浸泡于75%酒精內消毒10 min，剖腹剝離胎盤與羊膜，取出胎鼠。解剖顯微鏡下分離胎鼠脊髓步驟如下：以背部正中位置的紅色血管為標記，沿下方5 mm處劃破椎管，暴露脊髓；固定小鼠兩側臀部，從尾部挑出脊髓末端，分離背根神經與脊髓的粘連，快速剝離脊髓(盡量維持組織完整)。移至預冷的DPBS中，剝去表面血管與脊膜并漂洗1～2次。取材步驟見圖1,操作均在醫用冰盒上進行。將脊髓組織剪碎至黏稠糊狀，加入0.25%含EDTA的胰蛋白酶，混勻，消化15～20 min，加入1.5～2倍體積的完全培養基(DMEM高糖培養基+10%胎牛血清+1%青霉素+1%鏈霉素)終止消化,移入離心管，輕柔吹打制成細胞懸液，靜置5 min，待組織碎片自然沉降，收集上層2/3液體。剩余組織團塊中再添加適量完全培養基，輕柔混勻后靜置5 min，收集上層2/3液體。合并2次細胞懸液，1 000 r/min離心3 min，棄上清液。細胞沉淀中加入適量完全培養基重懸，接種于培養瓶中(25 mg/L PLL提前包被30 min)，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，2 d全量換液1次。

注：A為昆明孕鼠，B為胎鼠，C漂洗干凈的脊髓。圖1 胎鼠脊髓取材Fig.1 The procedure of collecting spinal cords of fetal mice

1.2.2星形膠質細胞與小膠質細胞分離純化 細胞培養4～5 d后，匯合度約為90%～95%，此時的細胞為混合膠質細胞；將混合膠質細胞置于37 ℃、300 r/min軌道搖床中，振搖4～6 h后收集瓶內培養基。由于小膠質細胞貼壁不牢固，收集的培養基中絕大多數為振搖下來的小膠質細胞，1 000 r/min離心3 min，棄去上清，加入完全培養基重懸均勻，接種于另一培養瓶內進行培養，該瓶細胞即為原代(P0)小膠質細胞。原培養瓶中未被振搖下來的細胞即為P0星形膠質細胞，由于星形膠質細胞的數量遠遠多于小膠質細胞，振搖后瓶底細胞的匯合度也已達到75%～85%；對P0星形膠質細胞進行一次傳代，先用PBS清洗1～2次，添加胰蛋白酶2 mL，恒溫消化3 min；細胞形態出現回縮變圓、呈片狀脫落時，立即加入完全培養基終止消化；細胞懸液移至離心管1 000 r/min離心3 min，棄去上清液；細胞沉淀中加入4 mL完全培養基制成細胞混懸液，按1 ∶2傳代，傳代后的細胞即為P1星形膠質細胞。

1.2.3星形膠質細胞和小膠質細胞鑒定 光學顯微鏡下觀察細胞形態，利用細胞熒光染色法鑒定P1星形膠質細胞純度或P0小膠質細胞純度，步驟如下：將細胞接種于玻璃爬片，匯合達到60%左右時，4%多聚甲醛室溫固定15 min，再加0.1%的TritonX-100室溫孵育10 min進行細胞穿透；10%山羊血清室溫封閉1 h，兔多抗克隆GFAP抗體(1 ∶200，鑒定星形膠質細胞)或兔多抗克隆CD11b抗體(1 ∶200，鑒定小膠質細胞)；4 ℃孵育過夜；Dylight 488羊抗兔二抗(1 ∶200)室溫避光孵育1 h，DAPI室溫避光染核5 min；甘油封片后，于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 細胞形態觀察

2.1.1星形膠質細胞 經恒溫搖床(300 r/min，4～6 h)純化、尚未傳代的星形膠質細胞為P0星形膠質細胞，其胞體延伸出的突起短而粗大，呈單層扁平星狀，細胞核大，呈卵圓形或圓形，核仁不明顯。傳代后，P1星形膠質細胞的胞體逐漸變大，生長速度加快，12 h后匯合度即可達到60%，1～2 d細胞即可鋪滿瓶底。隨著傳代次數的增加，細胞的生長速度不斷增加，但從第5代開始細胞活力逐漸下降。因此，在實驗中應選擇4代內的星形膠質細胞。見圖2。

注：A為未經純化的混合膠質細胞，B為P0星形膠質細胞，C為接種12 h后的P1星形膠質細胞。圖2 純化過程中星形膠質細胞的形態變化(10×)Fig.2 The morphological changes of astrocytes in different cell passages during purification process(10×)

2.1.2P0小膠質細胞 P0小膠質細胞是混合膠質細胞經振搖后從上清液中收集得到的，其數量遠遠少于星形膠質細胞，生長速度也較慢。接種第3天，鏡下可見小膠質細胞形態多為圓形、桿狀、阿米巴狀(均為激活態)或細長分支狀(靜息態)。接種第8天，其突觸延長，匯合度到達60%～70%。約在10～12 d，細胞呈多分枝狀，細胞間相互交織，匯合度達到90%。見圖3。

注：A為接種后第3天，B為接種后第8天，C為接種第12天。圖3 純化后的P0小膠質細胞形態變化(10×)Fig.3 The morphological changes of P0 microglia at different time points after purification(10×)

2.2 細胞純度鑒定

2.2.1星形膠質細胞 經過軌道搖床和傳代后，采用免疫熒光法對P1星形膠質細胞進行鑒定。如圖4所示，綠色熒光為陽性細胞，藍色熒光為細胞核。結果表明星形膠質細胞的陽性率可達97%以上。

2.2.2P0小膠質細胞 經過軌道搖床純化后，采用免疫熒光法對P0小膠質細胞進行鑒定。如圖4所示，綠色熒光為陽性細胞，藍色熒光為細胞核。結果顯示純化后的小膠質細胞的陽性率可達97% 以上。

圖4 免疫熒光法鑒定星形膠質細胞和小膠質細胞純度(20×)Fig.4 The purity of astrocytes and microglias were identified by immunofluorescent staining(20×)

3 討論

星形膠質細胞與小膠質細胞是中樞神經系統中重要的膠質細胞，協同維持中樞神經系統的穩定。近年來，它們被廣泛作為中樞神經系統疾病如帕金森(parkinson,s disease, PD)、肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, AST)、阿爾茨海默癥(alzheimer disease, AD)等的體外研究對象[5]。因此，快速、便捷獲得高純度的星形膠質細胞與小膠質細胞是研究中樞神經系統相關疾病的重要前提。

目前，大部分文獻以大腦皮質作為提取原代膠質細胞的組織來源[1, 6-9]，采用脊髓進行膠質細胞培養的文獻報道較少，而以昆明胎鼠作為組織來源更是未見報道。本研究從昆明胎鼠(孕晚期)的脊髓組織中提取混合膠質細胞，并在較短的時間內同時獲得數量多、純度高的星形膠質細胞與小膠質細胞。考慮到孕晚期昆明胎鼠的神經系統內神經元已經基本發育完全，而膠質細胞正處于旺盛增殖階段。此時取材有利于得到的狀態好、污染少的膠質細胞。

混合膠質細胞若未經分離、純化，通常摻雜神經元和成纖維細胞。神經元適合于無血清培養，而本研究采用的是含血清的膠質細胞培養基，神經元中會逐漸自然死亡。成纖維細胞與膠質細胞的培養條件相似，兩者會長期共存，因此需要人為將其除去。現有研究多采用差速貼壁法以去除成纖維細胞[9-10]，然而在實際操作中，需要精準控制成纖維細胞貼壁的時間。時間過長則部分膠質細胞也會隨之貼壁，致使目的細胞流失；時間過短則不能有效剔除成纖維細胞，最終導致實驗失敗。由于成纖維細胞來源于脊膜等粘膜結締組織，可以從源頭減少其來源。因此在我們的實驗中，通過反復摸索，調整剝離脊髓組織的方法可有效減少了成纖維細胞的來源。

在星形膠質細胞的培養方面，文獻報道未純化的星形膠質細胞需要9～14 d才能達到90%的匯合度[11-14]，細胞生長緩慢，不利于后續實驗的開展。在本研究中，采用胰酶消化法與機械吹打提取混合膠質細胞，采用恒溫定軌搖床結合傳代進行除雜，無需濾網，手法簡單，操作容易，細胞流失少，污染風險小。能在6～8 d獲得數量多、純度高的目的細胞，顯著提高了工作效率。

在小膠質細胞的培養方面，文獻報道的分離純化方法主要有：(1)胰酶消化法。即采用0.062 5%的胰酶作用于混合膠質細胞，邊消化邊搖晃，減少小膠質細胞對底部膠質細胞黏附性[15]。此方法確實可去除部分雜細胞，但黏附在瓶底的星形膠質細胞需再次經歷胰酶消化、吹打后進行傳代，增加了對細胞的二次損傷；(2)十字手搖法[12]，即按“十”字軌道搖動培養瓶獲得小膠質細胞；但實際操作中，操作人員不同，力度無法統一；力度太小，目的細胞無法脫落，力度過大，容易形成氣泡，破碎的氣泡張力又會影響細胞活力;(3)拍打法[16]，即通過拍打培養瓶底，促使小膠質細胞脫落，此方法與十字手搖法一樣，難以統一拍打力度。在本研究采用的恒溫搖床振蕩法(300 r/min，37℃，4～6 h)，條件穩定，獲得的小膠質細胞純度高，10～12 d即可達到90%以上的匯合度。

此外，本文建立的方法簡便易行，但操作時應注意以下幾方面：(1)消化時間要適宜，時間過短獲得的細胞數量少，時間過長容易致細胞破碎死亡[17]；脊髓組織消化時間應控制在15～20 min，星形膠質細胞與小膠質細胞傳代的消化時間控制在3～5 min與1～2 min比較適宜；(2)細胞接種密度要適宜，膠質細胞偏好聚集生長，細胞間彼此接觸、相互影響，促進成熟和增殖[18]，密度過低不利于形成細胞群落，一般11～15條完整的脊髓或者接種密度大于1×108個/L能滿足要求；(3)吹打細胞要輕柔，P0代膠質細胞非常敏感，吹打力度盡量輕柔，次數控制在10～15次；另外，吹打時吸管應貼壁置于離心管底部，力度均勻，可減少氣泡產生，防止氣泡破碎產生的張力影響細胞活性；(4)PLL包被條件要適宜，預先用PLL包被培養瓶可以促進膠質細胞貼壁，加快其生長速度[19]；濃度過高會有游離的PLL對細胞產生毒害，濃度過低則起不到幫助貼壁的作用。通過摸索，本研究確定25 mg/L PLL處理T25培養瓶30 min效果最佳。接種15～20 min，即可見90%的細胞貼壁。不管是原代混合膠質細胞，還是分離純化后的星形膠質細胞與小膠質細胞，生長速度均提高。

綜上，本方法可同時獲得數量多、純度高的星形膠質細胞與小膠質細胞，可降低實驗成本，顯著提高實驗效率，非常適合于膠質細胞的相關研究。期望本研究所提供的原代脊髓源星形膠質細胞與小膠質細胞分離純化方法，能為相關的中樞神經系統疾病研究提供支持。