DC聯合CIK治療對肝癌模型大鼠免疫功能的影響*

韋運豪， 張帥， 何偉， 趙許亞， 宋杰， 周石

(貴州醫科大學 影像學院， 貴州 貴陽 550004)

肝癌是消化系統最常見的實體腫瘤，也是全球常見的惡性腫瘤[1]，在中國發病率較高，其總體死亡率僅次于肺癌[2]，且肝癌的進展涉及復雜的病理和生理過程[3]。隨著生物療法的發展，已經表明針對腫瘤的靶向治療具有高效率、低毒副作用[4]。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cells, CIK)具有主要組織相容性復合體不受限制的抗腫瘤活性[5]，并且屬于細胞毒性淋巴細胞的CD3、CD56子集[6]。CIK細胞在腫瘤治療中的應用有助于對殘留的微小病變或轉移性腫瘤的清除，從而抑制了腫瘤的轉移或復發，提高了患者的免疫力，成為腫瘤免疫治療的首選方式[7]。樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是一種特異性的腫瘤殺傷細胞，它有助于調節人體細胞的免疫功能。除了誘導抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的增殖外，DC還可以通過直接或間接的方式促進B細胞的增殖和活化，從而通過調節體液和細胞免疫在機體抗腫瘤中發揮重要作用[8]。前期的研究顯示CIK細胞和DC的共培養有利于細胞增殖并增強免疫功能[9]，但并未應用于肝癌的治療研究中，本研究主要探討DC聯合CIK治療在大鼠肝癌模型中的作用及其對免疫功能的調節，以期為肝癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 健康雄性Wistar大鼠45只、2月齡、SPF等級、體質量(250±20)g，由學校實驗動物中心提供，在室溫(21±1)℃、相對濕度50%～70%，光照/黑暗周期為12 h/12 h的環境中飼養，該研究方案通過學校實驗動物倫理委員會審核批準。

1.1.2主要試劑和耗材 RH-35腫瘤細胞(ATCC Cell Bank，Manassas，VA，USA)，Ficon淋巴細胞分離緩沖液(Haoyang Bio，廣東省廣州市，中國)，戊巴比妥鈉和利多卡(昭輝藥業，上海，中國)，聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene difluoride，PVDF)膜(Pall Life Sciences，Port Washington，NY，USA)，蛋白質印跡試劑(Beyotime，北京，中國)， ECL試劑(Amersham Biosciences；Little Chalfont，UK)，兔抗人Bcl-2單克隆抗體，兔抗人單克隆抗體，山羊抗兔辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的IgG二抗(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)。IFN-γ、重組人GM-CSF、IL-4、IL-2、IL-1及抗CD3單克隆抗體(Life Technology，Waltham，MA，USA)，用于IFN-γ、IL-4和TNF-α的ELISA試劑盒(B&D，；San Jose, CA, USA)，RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒(Axygen，Waltham，MA，USA)，酶標儀(BD，San Jose，CA，USA)。ABI7500熒光定量PCR(ABI，Waltham，MA，USA)，所有細胞株均在添加有10%胎牛血清，100 ug/mL鏈霉素和100 000 U/L青霉素(pH 7.2～7.4)的DMEM培養基中培養，并在37 ℃、5%CO2的潮濕培養箱中生長。

1.2 實驗方法

1.2.1動物的分組和治療 將大鼠腫瘤細胞RH-35制備為1×1011/L懸浮液，并原位接種在大鼠肝被膜下方0.04 mL[10]。2周后，將45只肝癌模型大鼠隨機均分別為對照組、CIK組(接受自體移植CIK回輸)和DC+CIK組(接受自體移植CIK和DC回輸)。

1.2.2自體CIK細胞和DC細胞的制備及回輸 在無菌條件下從鼠尾靜脈收集1.5 mL血液樣本保存在肝素處理過的試管中，Ficon淋巴細胞分離緩沖液用于分離PBMC。用RMPI-1640洗滌后，將細胞用自體血清重新分類，以2×109/L計數細胞的濃度接種到6孔板中，依次添加IFN-γ 1 000 U、IL-2 300 U、IL-1 100 U和抗CD3單克隆抗體50 μg/L，每2～3 d更換1次培養基，使細胞數計數濃度達到2×1011/L。DC細胞常規采血制備過程同前，隨后在37 ℃，5%CO2的潮濕箱中孵育2 h， 棄去上清液以獲得附著的細胞；加入含有1 000 000 U/L重組人GM-CSF和500 000 U/L IL-4的新鮮培養基。 每2～3 d更換1次培養基，在第7天收集懸浮細胞作為DC。在CIK組中，通過加入無菌鹽水將CIK細胞制成2.5 mL懸浮液，并通過尾靜脈回輸給大鼠[10]；在DC+CIK聯合組中，將自體CIK細胞和DC以5 ∶1的比例混合，并制備成2.5 mL細胞懸液，然后通過尾靜脈將其回輸至大鼠[10]。

1.2.3觀察腫瘤生長及樣本的收集 腫瘤種植后，分別于治療后1、4、7、10、13 d觀察腫瘤的生長，測量大鼠腫瘤的長徑和短徑(mm)，并通過長徑×短徑計算腫瘤的面積；通過真空管收集腹主動脈血樣，在室溫靜置30 min后離心(3 600 r/min、4 ℃、10 min)，收集上清，用于上機檢測谷草轉氨酶(aspartate transaminase, AST) 、丙氨酸轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、總膽紅素(total bilirubin, TBIL)和白蛋白(albumin, ALB)指標；兩周后處死大鼠收集肝腫瘤組織并儲存在-80 ℃下超低溫冰箱。

1.2.4ELISA法檢測IFN-γ、IL-4和TNF-α的分泌水平 按照測試試劑盒的說明書，使用ELISA試劑盒測定大鼠血清樣品的IFN-γ、IL-4和TNF-α水平?；跇藴蕽舛群拖鄳腛D值計算線性回歸函數，利用OD值計算樣品濃度。

1.2.5實時PCR測量Bcl-2和Bax的mRNA表達 用TRIzol試劑提取腫瘤組織總RNA，根據測試試劑盒說明書，通過反轉錄合成總DNA。使用Primer 6.0軟件根據靶基因序列設計引物，并由Sangon(上海，中國)合成，見表1。在以下條件下對靶基因進行實時PCR：55 ℃ 1 min，35個循環，每個循環包含92 ℃ 30 s、58 ℃ 45 s和72 ℃ 35 s，通過ABI 7500熒光定量PCR循環儀和內置軟件收集數據。以Gapdh為參考，進行熒光定量以計算所有樣品和標準品的CT值。首先繪制標準曲線，然后使用2-ΔΔCt方法進行半定量分析。

1.2.6蛋白質印跡測量Bcl-2和Bax蛋白表達 從各組中獲取的腫瘤組織，添加裂解緩沖液以在冰上使細胞破裂15～30 min，同時進行超聲處理(5 s，4次)；將混合物在4 ℃下以10 000 g離心15 min；將上清液轉移到新的試管中進行蛋白質定量，并在-20 ℃下保存。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質，然后通過半干法將其轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉去除非特異性結合位點2 h；加入兔抗人Bcl-2(1 ∶1 000)或抗人Bax單克隆抗體(1 ∶1 500)，在4 ℃下過夜孵育；磷酸鹽緩沖鹽水和Tween 20(PBST)洗滌后，添加山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)在室溫下孵育30 min；加入ECL試劑使膜顯影，然后進行X射線曝光。通過蛋白質成像系統和Quantity One軟件(Hercules，CA，USA)獲得用于測量條帶密度的結果，每個實驗重復4次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 肝癌腫瘤生長

肝癌腫瘤生長情況見圖1，比較3組腫瘤大小，結果顯示于治療后的第10和第13天時CIK治療組和DC+CIK聯合治療組腫瘤面積均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，且DC+CIK聯合療法組的腫瘤面積低于單純CIK治療組，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2) 與CIK組比較，P<0.05。圖1 DC+CIK聯合治療對腫瘤生長的影響Fig.1 Effect of DC+CIK combined treatment on tumor growth

2.2 血清ALT、AST、TBIL和ALB水平

治療2周后，與對照組比較，CIK組和DC+CIK組大鼠血清肝功能檢查發現，CIK治療組和DC+CIK聯合治療組AST、 ALT、TBIL及 ALB水平降低(均P<0.05)；且DC+CIK組比CIK組對肝功能的恢復更好(P<0.05)，見表2。結果表明DC+CIK聯合療法促進了癌癥模型大鼠肝功能的恢復。

表2 治療2周后各組大鼠肝功能指標ALT、AST、TBIL和ALBTab.2 ALT, AST, TBIL, and ALB in liver function indexes of rats at 2 weeks after the treatment

2.3 血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平

治療2周后，CIK組和DC+CIK組與對照組比較，血清IFN-γ、IL-4和TNF-α的水平均升高(P<0.05)；而與CIK組比較，DC+CIK組上述指標升高則更明顯(P<0.05)。見圖2。 提示CIK+DC聯合療法可促進細胞和體液免疫反應，并發揮抗腫瘤作用。

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與CIK組比較，P<0.05。圖2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平Fig.2 The levels of serum IFN-γ, IL-4,and TNF-α of rats in each group

2.4 肝癌組織Bcl-2、Bax表達

治療2周后，實時熒光定量PCR和Western blot檢測各組大鼠肝癌組織中Bcl-2、Bax的表達發現，CIK組和DC+CIK組較對照組顯著抑制腫瘤組織中Bcl-2的水平，并增強Bax的表達(P<0.05)。與CIK組比較，DC+CIK聯合治療對Bcl-2水平的抑制作用和對Bax表達的增強作用更明顯(P<0.05)。見圖3、圖4。

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與CIK組比較，P<0.05。圖3 各組大鼠肝癌組織中Bcl-2和Bax mRNA表達Fig.3 Expression of Bcl-2 and Bax mRNA in liver cancer tissues of rats in each group

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與CIK組比較，P<0.05。圖4 各組大鼠肝癌組織中Bcl-2和Bax蛋白表達Fig.4 Expression of Bcl-2 and Bax protein in liver cancer tissues of rats in each group

3 討論

目前肝癌的治療手段包括外科手術、放化療和介入療法[11]。然而，所有這些療法的療效均令人不甚滿意，例如高頻率的復發和轉移頻率導致其預后較差，因此，抗肝癌試劑的研發對于提高治療效果至關重要[12]。免疫療法是一種新興的腫瘤治療方法，IL-2、IFN-γ和CD3單克隆抗體誘導的CIK細胞，除了其主要組織相容性復合體不受限制的溶瘤作用外，它還具有集中在腫瘤部位發揮特異性抗腫瘤的作用[13]。目前的研究表明，與其他免疫治療細胞(例如LAK或CD3AK)相比，CIK細胞在體內能有效增殖，以及能夠大量分泌具有腫瘤殺傷作用特性的細胞因子，而這與外源性IL-2細胞因子的刺激和抑制無關，且沒有毒性作用[14]。單獨使用CIK細胞療法或與化學療法聯合使用時，CIK細胞療法在乳腺癌、肺癌或結腸癌中已顯示出令人滿意的療效[15]。故本研究以CIK治療為切入點，探討其在大鼠肝癌模型中的作用。

DC是最有效的抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells, APC)，并且是激活初級T細胞的唯一APC亞型，它可以通過直接或間接途徑誘導細胞毒性T細胞和B細胞的增殖和分化。研究人員發現，DC可以顯著增強CIK細胞的增殖并加速其成熟[16]。因此，DC與CIK細胞的結合可進行有效的細胞毒性作用，并對抑制腫瘤生長發揮協同作用[17]。然而，DC+CIK治療在大鼠肝癌模型中的功能和免疫調節作用尚未闡明。因此，本研究首先通過體內腫瘤細胞移植，建立了大鼠肝癌模型，然后回輸自體DC、CIK細胞。本研究的數據顯示，DC+CIK聯合療法可顯著縮小腫瘤大小并改善肝功能指標，這表明自體CIK和DC聯合療法除了能協同發揮抗腫瘤的作用，而且還可以讓肝功能得到一定程度的恢復。

本研究進一步發現，DC+CIK聯合療法可提高肝癌大鼠血清中的IFN-γ、IL-4和TNF-α的表達水平。作為細胞免疫反應的重要調控因子，IFN-γ可以促進Th0細胞分化為Th1細胞，而IL-4可以誘導Th0細胞分化為Th2細胞。 Th1和Th2細胞分別參與細胞和體液免疫反應[18]。因此，本研究的結果表明，DC+CIK聯合療法可在腫瘤抑制過程中上調細胞和體液免疫反應。Bcl-2的過表達和Bax的抑制與肝癌細胞的抗凋亡/凋亡失衡密切相關，因為這種平衡的破壞會導致細胞活性異常[19]。本實驗在mRNA和蛋白質水平上的研究表明，DC+CIK聯合療法在肝癌組織中降低了Bcl-2的表達的同時，也增強了Bax的表達，表明通過促凋亡功能產生的抗腫瘤作用，這與先前一些學者的報道一致[20]。

綜上所述，DC+CIK聯合療法可通過調節細胞凋亡和抗凋亡的平衡，同時能夠改善人體免疫功能并發揮抗腫瘤的作用，這比單獨使用CIK具有更好的療效，其可能為將來肝癌提供一種新型生物療法的治療策略。