RANK基因2個SNP位點多態性與貴州燃煤污染型地氟病患病風險的相關性*

趙安宿， 田薇， 李瑞超， 喻艷琴， 王嬋娟， 張婷， 吳昌學*， 何燕*

(貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室 & 貴州省醫學分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

氟是一種常見的微量元素,參與人體生命活動的調節，人體每日攝入適量的氟,可促進牙齒和骨骼的發育,預防齲齒[1]；但是氟過量也會導致人體中毒,嚴重者甚至會對人的生命健康造成威脅，產生以骨骼病變為主的地方性疾病[2-3]。根據氟化物的來源，地方性氟中毒分為飲水型氟中毒、飲茶型氟中毒、燃煤污染型氟中毒[4-6]，其中燃煤污染型地方性氟中毒(簡稱燃煤型地氟病)是由于居民長期在室內使用高氟煤取暖、烘烤食物，導致人體氟攝入過量引發的全身性慢性疾病[7]。研究發現，氟具有很強的親骨性，適量氟能促進骨骼發育，但過量氟攝入會影響骨形成與骨吸收，引發骨代謝紊亂導致氟骨癥，主要表現為關節僵直、腰腿關節疼痛、骨骼變形等癥狀[8-10]。近年來的研究發現，氟對骨骼的毒性作用機制復雜，除外界因素的刺激外，還可能受遺傳因素的影響[11]。流行病學調查發現，不同的人群對于氟暴露反應敏感性不同，氟骨癥的發病率存在差異[12]，提示遺傳因素可能與氟中毒的發病機制有關。RANK屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族成員之一，是一種Ⅰ型跨膜蛋白，由616個氨基酸殘基組成，基因定位于染色體18q21.33，全長3 809 bp，外顯子12個。RANK與核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)結合能引起破骨細胞分化成熟[13]。有研究報道RANK基因多態性與某些骨疾病有關系，Wang等[13]報道了RANK基因rs1805034位點CC基因型與骨關節炎的發生相關，Chen等[14]發現RANK基因rs884205基因多態性與肱骨頭壞死有關。但RANK基因的rs1805034和rs884205位點多態性與燃煤型地氟病的反生發展是否相關的報道較少。本研究在知情同意的原則下，以貴州省某燃煤污染型地氟病人群為調查對象，探討該人群外周血DNA中RANK基因的rs1805034和rs884205位點多態性與燃煤污染型地氟病患病的關系，報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇居住于貴州省六枝特區梭戛苗族彝族回族鄉(簡稱梭戛鄉)3年及以上、無顱腦外傷及精神疾病家族史的8～12歲在校小學生作為研究對象，在知情同意原則下，根據《氟斑牙診斷標準》(WS/T 208-2011)進行氟斑牙分度診斷，其中氟斑牙分度在極輕度及以上者為地氟組，分度正常者為對照組。入選人數：地氟組283人，平均年齡(10.32±1.46)歲，男139人、女144人；對照組200人，平均年齡9.89±1.31歲，男101人、女99人。

1.2 研究方法

1.2.1DNA模板標化 采集研究對象外周靜脈血5 mL，采用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取全血基因組DNA，用NanoDrop Lite紫外分光光度計[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]對DNA定量后，標化至30 mg/L，轉入96孔PCR反應板中作為模板DNA，封膜后-20 ℃保存備用。

1.2.2基因分型 采用TaqMan-MGB探針法對RANK基因rs1805034和rs884205位點進行基因分型。PCR反應總體系(10 μL)：TaqMan genotyping Master MixⅡ 3.0 μL，探針0.15 μL，DNA溶液(3 mg/L)1.0 μL，加無菌ddH2O補足至10 μL。PCR反應條件：60 ℃ 30 s，95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環40次；60 ℃ 30 s結束反應。采用Step one software v2.3軟件分析擴增結果。

1.2.3測序驗證 根據分型結果，每個SNP位點、每種基因型隨機抽取5%的樣本送生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證(不足5例的全部測序驗證)，測序結果與分型結果100%相符。測序引物序列見表1。

1.3 統計學分析

采用χ2檢驗對兩組樣本兩個 SNP位點基因型頻率進行Hardy-Weinberg平衡檢測， SPSS 22.0 統計軟件分析各SNP位點的等位基因、基因型頻率在各組間的分布差異；采用SNPstats對每個SNP位點基因型與燃煤型地氟病發生發展的相關遺傳模式進行分析，并根據赤池信息量準則(akaike information criterion，AIC)和貝葉斯信息準則(bayesian information criterions，BIC)來確定最優遺傳模式；采用在線軟件系統SHEsis對RANK基因rs1805034和rs884205位點之間進行連鎖不平衡分析，各個方塊的顏色由淺至深表連鎖程度由低到高。D′代表連鎖不平衡系數，顏色越深、D′值越大，代表兩位點之間連鎖不平衡越強；當D′>0.5時存在弱連鎖不平衡，D′> 0.8、且r2> 0.3時兩點間存在強連鎖不平衡，D′=1 存在完全連鎖不平衡；r2為相關系數。

2 結果

2.1 基因分型

研究采用Step One Software v2. 3軟件對 Real-time PCR 擴增分析，結果顯示RANK基因 rs1805034 位點在地氟病人群和對照組人群中均存在C和T等位基因以及3種基因型(即CC、CT、TT)，如圖1；rs884205位點在地氟病人群和對照組人群中均存在A和C等位基因以及3種基因型(即AA、 AC、CC )。見圖2。

注：紅點為CC野生型，綠點為CT雜合型，藍點為TT突變純合型，“X”為未確定。圖1 RANK基因rs1805034位點基因分型Fig.1 rs1805034 loci genotyping of RANK gene

注：紅點為CC野生型，綠點為AT雜合型，藍點為AA突變純合型，“X”為未確定。圖2 RANK基因rs884205位點基因分型Fig.2 rs884205 locus genotyping of RANK gene

2.2 測序驗證

隨機在每個SNP位點的每種基因型樣本中抽樣5%進行測序驗證，例數不足5例的全部測序，測序結果與基因分型結果完全符合。見圖3、圖4。

圖3 RANK基因 rs1805034位點測序結果Fig.3 Sequencing of rs1805034 of RANK gene

圖4 RANK基因 rs884205 位點測序結果Fig.4 Sequencing of rs884205 of RANK gene

2.3 rs1805034和rs884205等位基因及基因分型的分布頻率

rs1805034和rs884205位點的基因型頻率在地氟組和對照組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。在地氟組和對照組間兩個位點的等位基因及基因分型比較顯示：RANK基因rs1805034位點等位基因和基因型分布在地氟組和對照組之間差異有統計學意義(P<0.05)，rs884205位點基因型和等位基因分布在地氟組和對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 RANK基因多態性位點在地氟組和對照組中的分布頻率Tab.2 Distribution frequency of RANK gene polymorphism loci in the fluorosis group and control group

2.4 貴州梭戛RANK基因rs1805034和rs884205位點最優遺傳模式分析

采用 SNPStats 在線軟件對地氟組和對照組的RANK基因 rs1805034 位點和rs884205位點的等位基因進行最優遺傳模式分析， 探討2個多態性位點基因型與燃煤型地氟病發生的相關性。結果顯示RANK基因rs1805034位點最優遺傳模式為共顯性，在該遺傳模式下C/T基因型和T/T基因型相對于C/C基因型來說是燃煤型地氟病發生的保護因素(OR=0.17，95%CI為0.09～0.31；OR=0.04，95%CI為0.02～0.08)；rs884205位點與燃煤型地氟病的發生無相關性(P>0.05)。見表3。

表3 地氟組和對照組最優遺傳模式分析Tab.3 Analysis of optimal genetic model between fluorosis group and control group

2.5 貴州梭戛RANK基因rs1805034和rs884205位點在地氟組和對照組間連鎖不平衡分析

SHEsis分析結果顯示RANK基因多態性位點之間不存在連鎖不平衡(D′<0.5)。見圖5。

圖5 地氟組和對照組間2個多態性位點的連鎖不平衡分析Fig.5 Analysis of linkage disequilibrium of 2 polymorphism loci between fluorosis group and control group

3 討論

氟參與人體生命活動的調節，適量的氟不僅對牙齒和骨骼的發育有好處而且還可以預防齲齒[15]。但在牙齒和骨骼發育過程中氟的過量攝入可能會影響牙釉質的發展、導致骨穩態的紊亂，導致牙釉質缺失、骨骼氟中毒等癥狀，引起骨轉換障礙，導致各種骨骼病變，如骨硬化、骨質疏松和退行性關節改變[16]。氟中毒有急性和慢性氟中毒之分。慢性氟中毒比較常見，分為飲水、飲茶和燃煤污染型,其臨床特征均為氟斑牙和氟骨癥[17-18]。高氟刺激下，成骨細胞大量分泌骨鈣素，可參與骨代謝并調節相關激素表達水平，從而影響骨質生長發育、骨骼和非骨骼系統[19-20]。地氟病的發病機制和治療策略尚未闡明。隨著分子生物學技術的發展，對地氟病的發病機制進入了分子水平研究。

RANK基因對骨的形成和發育具有重要作用，其上SNP位點多態性與骨相關疾病的研究近年來屢見報道，Casas-Avila等[21]報道了RANK基因rs3018362位點多態性與骨質疏松癥具有相關性，Mohamed等[22]報道了RANK基因rs1805034位點多態性與絕經后婦女骨質疏松癥的發生有關。在本研究中對RANK基因rs1805034、rs884205位點進行多態性分型結果顯示，RANK基因rs1805034位點基因型在地氟組的分布為CC頻率42.8%、CT頻率46.6%、TT頻率10.6%，在對照組的分布為CC 頻率8.0%、CT頻率 46.0%、TT 頻率46.0%，差異有統計學意義(P<0.05)；等位基因在疾病組的分布為C 頻率66.1%、T 頻率33.9%，在對照組的分布為C頻率 31.0%、T頻率 69.0%，差異有統計學意義(P<0.05)；rs884205位點基因型和等位基因在地氟組和對照組之間分布差異無統計學意義(P>0.05)。最優遺傳模式分析RANK基因2個SNPs位點多態性與燃煤型地氟病發生的相關性，結果顯示RANK基因rs1805034位點最優遺傳模式為共顯性，在該遺傳模式下C/T基因型和T/T基因型相對于C/C基因型來說是燃煤型地氟病發生的保護因素(OR=0.17，95%CI為0.09～0.31；OR=0.04，95%CI為0.02～0.08)，其余位點與燃煤型地氟病的發生無相關性(P>0.05)，提示rs1805034位點C/T基因型和T/T基因型可能與燃煤型地氟病的發生有相關性。本研究對RANK基因多態性位點在地氟組和對照組中進行連鎖不平衡分析結果顯示，RANK基因上述2個多態性位點之間不存在連鎖不平衡(D′<0.5)，不能構建單倍型，因此無法通過連鎖不平衡來判斷RANK基因上述2個多態性位與燃煤型地氟病的關系。

綜上所述，本研究顯示RANK基因rs1805035位點可能與燃煤型地氟病的發生有關，rs884205可能與燃煤型地氟病的發生無關。由于本研究樣本量相對較少，容易產生統計偏差，還需進一步加大樣本量開展研究工作，從而闡述RANK基因 rs1805035、rs884205位點與燃煤型地氟病的相關性。