血清TLR-9、25-(OH)D3水平與糖尿病足感染患者血糖指標(biāo)及病情程度的相關(guān)性

張丹丹，張娜娜，畢菲菲

(1.唐山市中醫(yī)醫(yī)院門(mén)診；2.唐山市婦幼保健院生殖遺傳科；3.唐山市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 唐山 063000)

全球的糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者已超過(guò)4.15億，且患病率仍在增加，國(guó)內(nèi)情況尤為嚴(yán)峻，約占全球發(fā)病率的22.22%(1/4.5)。糖尿病足(diabetic foot，DF)是最常見(jiàn)的DM慢性并發(fā)癥之一，我國(guó)DF發(fā)病率高達(dá)15%。目前，糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)的治療仍是一項(xiàng)臨床難題，年齡、長(zhǎng)病程、血糖控制不佳、營(yíng)養(yǎng)不良、局部感染病變嚴(yán)重等因素可對(duì)DFU預(yù)后產(chǎn)生影響，而高血壓、血脂代謝異常、神經(jīng)病變、腎功能衰竭可能均與DFU的遷延不愈和患者死亡缺乏相關(guān)性[1]。糖尿病足感染(diabetic foot infection，DFI)則是導(dǎo)致DFU難以愈合和不良預(yù)后的直接因素，因此DFI的早期診斷和有效評(píng)價(jià)具有重要的臨床意義。DFU的進(jìn)展與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子異常密切相關(guān)，其中血清生物學(xué)標(biāo)志物尤為關(guān)鍵，譬如Toll樣受體9(toll-like receptor 9，TLR9)和25羥維生素D3(25 hydroxy-vitamin D3，25-(OH)D3)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的兩種與DM并發(fā)癥具有相關(guān)性的標(biāo)志物[2-3]，但是否與DFI病情程度具有相關(guān)性仍存在爭(zhēng)議。故本研究擬探討血清TLR-9、25-(OH)D3水平與DFI患者血糖指標(biāo)及病情程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2020年1月唐山市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的60例DFI患者作為DFI組，同期60例未合并DFI的DM患者作為DM組，同期100名排除DM的體檢者作為對(duì)照組。三組研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)自愿參與本研究，本研究方案經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)DM的診斷依據(jù)參照美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)制訂的《糖尿病醫(yī)學(xué)診療標(biāo)準(zhǔn)(2019年版)》[4]；(2)DFI的診斷依據(jù)國(guó)際糖尿病足工作組(international working group on the diabetic foot，IWG-DF)制訂的《糖尿病足感染診斷和治療指南(2019年更新)》[5]；(3)對(duì)照組均經(jīng)臨床檢查排除DM；(4)臨床資料完整；(5)年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠期糖尿病及繼發(fā)性糖尿病患者；(2)合并急性糖尿病并發(fā)癥或其它慢性并發(fā)癥終末期患者；(3)合并惡性腫瘤、重要器官功能不全、急慢性感染性疾病、自身免疫疾病或免疫缺陷病的患者；(4)妊娠期或哺乳期患者；(5)入組前已對(duì)DFI進(jìn)行治療的患者；(6)入組前1個(gè)月具有應(yīng)用可能影響(25)-OH D3代謝藥物史的患者。

1.2 方法

1.2.1 基線資料及血糖指標(biāo)對(duì)比 對(duì)三組研究對(duì)象的年齡、性別構(gòu)成、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、腰臀比(WHR)、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(GHB)、空腹胰島素(FINS)水平進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)，其中，血糖指標(biāo)為采集空腹靜脈血進(jìn)行檢測(cè)，DFI組和DM組患者的采血時(shí)間為入院次日，對(duì)照組研究對(duì)象的采血時(shí)間為體檢當(dāng)日。FBG的檢測(cè)采用COBAS C501型全自動(dòng)血液生化分析儀(瑞士羅氏公司)，GHB的檢測(cè)采用離子交換層析法，F(xiàn)INS的檢測(cè)采用放射免疫法，HOMA-IR的計(jì)算公式為FBG×FINS/22.5。

1.2.2 血清TLR-9、25-(OH)D3水平檢測(cè) 于上述采血時(shí)點(diǎn)另取真空管采集三組研究對(duì)象的靜脈血樣本3 mL，在室溫下靜置2 h凝固后以3 000 rpm的速度離心15 min，移取血清樣本置于-18℃中保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)對(duì)血清TLR-9水平進(jìn)行檢測(cè)，人TLR-9 ELISA試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，采用電化學(xué)發(fā)光法對(duì)血清25-(OH)D3水平進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒購(gòu)于瑞士羅氏公司，以上檢測(cè)步驟均嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 病情程度評(píng)價(jià) 采用Wagner分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]對(duì)DFI組患者進(jìn)行病情評(píng)價(jià)，DFI患者的Wagner分級(jí)為2～5級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：(1)2級(jí)：出現(xiàn)較深的、穿透性潰瘍病灶，感染類(lèi)型為軟組織感染，但排除骨髓炎或深部膿腫。(2)3級(jí)：潰瘍病灶累及骨組織，感染類(lèi)型為深部膿腫或骨髓炎。(3)4級(jí)：潰瘍病灶出現(xiàn)局部或特殊部位壞疽，部分病灶無(wú)嚴(yán)重疼痛感，壞死組織表面有明顯感染表現(xiàn)。(4)5級(jí)：壞疽病變蔓延至整個(gè)足部，可合并發(fā)生大動(dòng)脈阻塞、神經(jīng)病變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DFI組與DM組患者基線資料和血糖指標(biāo)的比較

DFI組患者的GHB、FINS、HOMA-IR水平均高于DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 DFI組與DM組患者基線資料和血糖指標(biāo)的比較

2.2 三組血清TLR-9、25-(OH)D3水平的比較

對(duì)照組、DM組、DFI組的血清TLR-9水平依次升高，血清25-(OH)D3水平依次降低，以上各組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三組研究對(duì)象血清TLR-9、25-(OH)D3水平的比較

2.3 DFI患者血清TLR-9、25-(OH)D3水平與血糖指標(biāo)及病情程度的相關(guān)性

DFI組患者的Wagner分級(jí)情況為：2級(jí)11例(18.33%)、3級(jí)20例(33.33%)、4級(jí)22例(36.67%)、5級(jí)7例(11.67)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，患者的Wagner分級(jí)與血清TLR-9呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與25-(OH)D3水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。Pearson等級(jí)相關(guān)結(jié)果顯示，患者的GHB、FINS、HOMA-IR水平均與血清TLR-9呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與25-(OH)D3水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，而患者的FBG水平與上述兩個(gè)指標(biāo)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 DFI患者血清TLR-9、25-(OH)D3水平與血糖指標(biāo)及病情程度的相關(guān)性

3 討論

DFU的臨床治療方案主要依據(jù)其病情程度，僅合并淺表DFI的患者多采用內(nèi)科治療輔以清創(chuàng)術(shù)、高壓氧治療、負(fù)壓封閉引流等[7]，血管病變嚴(yán)重的患者可酌情采用介入治療，但這些方法通常無(wú)法完全逆轉(zhuǎn)DFI的進(jìn)展和復(fù)發(fā)。當(dāng)感染進(jìn)展至骨髓炎階段，治療費(fèi)用和難度會(huì)大幅度上升，且治療效果和預(yù)后通常較差[8]。Wagner分級(jí)是評(píng)價(jià)DFU病情的公認(rèn)可靠指標(biāo)，其主要依據(jù)之一就是DFI的進(jìn)展程度，一般來(lái)說(shuō)，隨著Wagner分級(jí)的升高，患者的截肢率風(fēng)險(xiǎn)也不斷升高，不論是否截肢，嚴(yán)重DFI患者的死亡率均可達(dá)近30%[9]。本研究顯示，DFI患者的Wagner 3級(jí)以上患者>80%，Wagner 4級(jí)以上患者近50%，感染病情相對(duì)較重，可能與入選研究對(duì)象均為住院病例有關(guān)。傳統(tǒng)的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，DFI的病情程度主要與血液感染標(biāo)志物、趾肱指數(shù)、ALB、HB及血脂代謝指標(biāo)有關(guān)，但進(jìn)一步研究[10]結(jié)果顯示，這些傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)在DM患者中往往波動(dòng)性較大，且與急性感染的發(fā)生關(guān)系更加密切，難以用于評(píng)價(jià)DFI等慢性感染病情，而血糖控制指標(biāo)和免疫炎癥因子水平可能對(duì)DFI的影響更大，從免疫炎癥機(jī)制角度篩選適于DFI患者的新型預(yù)后標(biāo)志物成為了學(xué)術(shù)界努力的方向。本研究選取了TLR-9和25-(OH)D3作為主要研究指標(biāo)，研究結(jié)果支持了這兩種標(biāo)志物與DFI患者血糖指標(biāo)和病情程度具有相關(guān)性的結(jié)論，為進(jìn)一步的研究提供了有益的思路。

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)屬于模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)，在機(jī)體識(shí)別和抵御病原微生物的過(guò)程中扮演著重要的角色。病原微生物能夠被TLRs等PRR所識(shí)別，從而激活下游信號(hào)通路、介導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生。相關(guān)研究[11]已證實(shí)，TLR-2、TLR-4等TLRs與DF、糖尿病腎病等的發(fā)生密切相關(guān)，其血清表達(dá)水平與患者的糖代謝指標(biāo)、炎癥因子水平和糖基化終產(chǎn)物水平均具有相關(guān)性。而本研究結(jié)果提示了血清TLR-9水平與DFI病情程度具有相關(guān)性，其可能機(jī)制：(1)DFI的病原體以細(xì)菌為主，而細(xì)菌基因組中廣泛存在著以未甲基化的胞嘧啶—鳥(niǎo)嘌呤核苷酸為核心的基序，這一病原分子模式能夠激活B淋巴細(xì)胞、類(lèi)漿細(xì)胞等免疫細(xì)胞從而誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答，在此過(guò)程中，TLR-9能夠識(shí)別病原分子模式激活信號(hào)通路，從而激活固有免疫系統(tǒng)、上調(diào)前炎癥細(xì)胞因子，介導(dǎo)固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[12]，因此DFI患者的血清TLR-9水平能夠敏感地反映機(jī)體針對(duì)細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答水平，從而有效指示DFI的病情程度。(2)在細(xì)菌或病毒感染性疾病的過(guò)程中，血清TLR-9表達(dá)上調(diào)與患者的外周血淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)及其轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白狀態(tài)紊亂有關(guān)[13]，故DFI患者的血清TLR-9水平能夠提示糖代謝紊亂導(dǎo)致的免疫功能損害程度，從而間接反映機(jī)體的長(zhǎng)期血糖控制效果和感染程度。

DM患者中維生素D缺乏現(xiàn)象十分普遍，維生素D已被證實(shí)具有保護(hù)胰島β細(xì)胞、減輕胰島素抵抗、抑制炎癥因子表達(dá)、抗氧化應(yīng)激、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性、延緩動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)足細(xì)胞等作用，故維生素D缺乏可能與DM的發(fā)生和并發(fā)癥的出現(xiàn)密切相關(guān)[14-17]。本研究表明，DFI患者的病情程度和糖代謝指標(biāo)與維生素D缺乏程度有關(guān)，其可能機(jī)制：(1)維生素D缺乏可通過(guò)干擾DFI患者血糖血脂穩(wěn)態(tài)、提升炎癥反應(yīng)程度和氧化應(yīng)激水平、加重周?chē)窠?jīng)病變等機(jī)制影響DFU創(chuàng)面的愈合和組織生長(zhǎng)[18]，從而導(dǎo)致了DFI病變的持續(xù)進(jìn)展。(2)維生素D缺乏可通過(guò)上調(diào)炎癥反應(yīng)水平、促進(jìn)氧化應(yīng)激等機(jī)制進(jìn)一步加劇DFI患者機(jī)體的免疫損害，從而使其多藥耐藥菌感染風(fēng)險(xiǎn)上升，特別是中度及重度維生素D缺乏患者在DFU愈合后更易出現(xiàn)復(fù)發(fā)[19]，而多藥耐藥菌感染和DFU復(fù)發(fā)導(dǎo)致了感染治療效果不佳和病情進(jìn)展。

綜上所述，DM患者血清TLR-9水平的升高、血清25-(OH)D3水平的降低，且TLR-9、25-(OH)D3與DFI的發(fā)生發(fā)展及機(jī)體糖代謝異常相關(guān)。