免疫性血小板減少癥患者外周血Th17/Treg相關因子的表達及意義

仲曉玲，吳文靜

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院輸血科，江蘇 南京 210008)

免疫性血小板減少癥(immunologic thrombocytopenic purpura，ITP)是一種自身免疫出血性疾病，以血小板計數減少為主要表現，并可伴隨皮膚、黏膜甚至內臟出血[1-2]。近年來，隨著現代社會生活壓力的增大，免疫類疾病越來越高發，ITP的發病率也呈逐年上升趨勢，嚴重威脅人們生命健康。ITP的發病機制尚未完全明確，免疫功能紊亂被認為在其中發揮著重要作用，最初的研究多集中于體液免疫方面，認為體液免疫異常是ITP的主要致病因素[3]。近年研究[4]發現，輔助性T細胞(helper T cell，Th)亞群的免疫異常與ITP發病具有關聯性。輔助性T細胞17/調節性T細胞(helper T cell 17/regulatory cells，Th17/Treg)的免疫失衡參與了自身免疫性疾病的病理改變過程[5-6]。Th17細胞能夠分泌致炎性細胞因子白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)，Treg細胞可分泌IL-10等重要效應細胞因子，二者在分化、功能上均相互拮抗，共同維持機體免疫狀態的相對穩定。本研究旨在通過檢測ITP患者外周血Th17、Treg比例及血清IL-17、IL-10水平變化，探討Th17/Treg及相關因子失衡在ITP發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月至2021年6月在南京大學醫學院附屬鼓樓醫院確診的ITP患者60例(ITP組)，其中男性28例，女性32例；年齡18～71歲，平均(48.65±8.95)歲。納入標準：(1)符合ITP診斷標準[7]，初次發病；(2)尚未接受過血小板輸注；(3)未行脾切除治療；(4)未服用對凝血功能有影響的藥物。排除標準：(1)合并其他自身免疫性疾病者；(2)急慢性感染者；(3)惡性腫瘤患者；(4)有血液系統疾病史者。另選取60名同期健康體檢者作為對照組，均排除自身免疫性疾病、血液系統疾病等，其中男性33例，女性27例；年齡20～65歲，平均(47.11±9.36)歲。兩組性別構成、年齡對比，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經本院醫學倫理委員會批準，入組對象均簽署知情同意書。

1.2 Th17、Treg細胞的檢測

入組對象均于次日清晨抽取空腹狀態下靜脈血3 mL，放置在含枸櫞酸鈉的抗凝管中，采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)等體積稀釋，應用人淋巴細胞分離液分離獲得外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCS)，用RPMI 1640培養基調整細胞濃度至2×106/mL，然后接種到24孔板，37 ℃孵箱中培養4 h。參照試劑盒說明書步驟進行操作，配置完畢后等待上機檢測。應用流式細胞儀對Th17、Treg細胞比例進行檢測。

1.3 血清IL-17、IL-10的測定

采集研究對象血清，置于-70 ℃環境下保存，最后進行統一檢測。采用酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法進行IL-17、IL-10的檢測，嚴格按試劑盒說明書進行具體步驟操作。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 ITP患者外周血Th17、Treg細胞比例及其比值變化

相比對照組，ITP患者外周血Th17細胞比例和Th17/Treg比值增高，Treg細胞比例降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 ITP患者與對照組外周血Th17、Treg細胞比例及其比值比較

2.2 ITP患者血清及IL-17>、IL-10水平及其比值變化

相比對照組，ITP患者血清IL-17水平和IL-17/IL-10比值增高，IL-10水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 ITP患者血清及IL-17、IL-10水平及其比值變化

2.3 Th17/Treg細胞及相關因子與血小板計數的相關性分析

ITP患者血小板計數為(18.26±10.37)×109/L，與外周血Treg細胞比例、IL-10水平呈正相關(r=0.823、0.744)，而與外周血Th17細胞比例、IL-17呈負相關(r=-0.881、-0.743)。見圖1。

3 討論

ITP的發病是多種機制共同參與導致，但免疫功能紊亂是其核心發病機制，以T細胞為主的免疫功能紊亂在疾病發生發展中起著重要作用，機體免疫異常可致使機體抗血小板抗體與血小板發生結合，使得網狀內皮細胞遭到破壞，從而造成血小板破壞增多，血小板數目減少[8]。既往研究[9-11]發現，ITP患者體內存在T細胞亞群失衡、相關細胞因子異常表達，其中細胞免疫功能失調是ITP發病的關鍵環節之一，如Th1/Th2、Th17/Treg細胞平衡失調等。

Th17細胞可與Th1細胞發揮協同作用，共同參與自身免疫性疾病的病理過程。Th17細胞與Treg細胞雖有著相同的分化過程，但兩者功能相互拮抗，在正常情況下，二者處于平衡狀態，Th17/Treg細胞的動態平衡有助于維持機體免疫狀態的穩定，而Th17/Treg失衡是導致自身免疫性疾病發病的重要機制。Th17細胞、Treg細胞是由CD4+T淋巴細胞分化而成的兩種細胞新亞群。當機體有炎癥反應時，IL-6、轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)共同誘導CD4+T淋巴細胞分化成為Th17細胞；機體不存在炎癥反應時，TGF-β單獨誘導CD4+T淋巴細胞分化為Treg細胞[12]。由Th17細胞所分泌的致炎細胞因子IL-17能夠促進炎癥因子表達，進而促進自身免疫性疾病的發生發展[13]。而Treg細胞分泌的抗炎因子IL-10則能夠和細胞間直接接觸而介導免疫抑制[14]。周正菊等[15]指出，ITP患者外周血Th17細胞比例顯著增高。本研究也發現，ITP患者外周血Th17細胞比例和血清IL-17水平顯著高于對照組，表明ITP患者存在Th17細胞和相關因子異常表達現象，這可能是ITP的重要病理機制之一。

本研究顯示，ITP患者外周血Treg細胞比例和IL-10水平顯著低于對照組，免疫抑制功能的減弱，與張萍等[16-17]報道一致。此外，本研究還指出研究報道，Th17/Treg細胞失衡所致的機體免疫異常，可能參與了ITP的病理機制，與Yazdanbakhsh等[18]研究與之一致。Th17細胞增多，Treg細胞減少，可使得機體免疫平衡遭到破壞，導致免疫失衡，從而誘發ITP[19-20]。本研究相關性分析顯示，ITP患者血小板計數與外周血Treg細胞比例、IL-10水平呈正相關，而與外周血Th17細胞比例、IL-17呈負相關，提示ITP患者外周血Th17、Treg細胞比例和IL-17、IL-10水平可能能夠反映病情嚴重程度。

綜上所述，ITP患者存在Th17/Treg細胞失衡及相關因子異常表達，Th17/Treg失衡可能參與了ITP的發生發展。