刺芒柄花素對(duì)順鉑所致大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

郝炎，李治成，陳越，劉文佳，鐘卿

(自貢市第一人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科，四川 自貢 643000)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一組表現(xiàn)為短期內(nèi)腎小球?yàn)V過率急劇下降，并伴有水電解質(zhì)及酸堿平衡紊亂和循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等全身癥狀的臨床綜合征[1]。引發(fā)急性腎損傷的病因很多，藥物使用是其中之一。順鉑是一種細(xì)胞周期非特異性藥物，主要通過腎排泄，依賴腎小球的過濾或部分腎小管的分泌，腎毒性較大，易引發(fā)腎損傷。Wang等[2]研究報(bào)道使用順鉑治療后，25%～30%的患者出現(xiàn)急性腎損傷，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量。大量研究[3-6]表明，順鉑致細(xì)胞損傷的主要機(jī)制包括DNA損傷、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙及凋亡等，且促進(jìn)和抑制線粒體的分裂及凋亡途徑均可改變急性腎損傷程度。因此，研究抑制細(xì)胞線粒體的分裂及凋亡的分子機(jī)制對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷的防治具有重要的臨床意義。刺芒柄花素是一種廣泛存在于紅車軸草中的異黃酮類化合物，具有抗炎、抗癌功效，可降低血脂，改善肝脂肪化、減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、抑制動(dòng)脈壁內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞形成和中膜平滑肌增生[7]。楊飛飛[8]研究發(fā)現(xiàn)，通過缺血再灌注建立腎損傷小鼠模型，在缺血前后給予一定劑量刺芒柄花素，toll樣受體4(toll-like receptors 4，TLR4)及高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)蛋白表達(dá)較模型組顯著減少，表明刺芒柄花素預(yù)處理可減輕腎臟缺血再灌注損傷。但對(duì)于順鉑誘導(dǎo)的AKI，刺芒柄花素保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究擬明確藥物刺芒柄花素對(duì)線粒體分裂的調(diào)節(jié)作用，為AKI的防治提供新的參考方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

脫水機(jī)(型號(hào)：ASP300S，Leica)、切片機(jī)(型號(hào)：HistoCore BIOCUT，Leica)、離心機(jī)(型號(hào)：Multifuge X1/X1R Pro，賽默飛)、DNA擴(kuò)增儀(型號(hào)：T100，BIORAD)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(型號(hào)：LightCycler 480，羅氏診斷)、激光共聚焦顯微鏡(型號(hào)：Echo REVOLUTION，ECHO)、紫外分光光度計(jì)(型號(hào)：U-3900/3900H，日立)、灰度分析軟件(型號(hào)：alphaEaseFC，Alpha Innotech)，全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)：AU5800，貝克曼庫爾特)。

刺芒柄花素購自上海雅吉生物科技有限公司、順鉑(Sigma-Aldrich)、2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸(bicinchoninic acid assay，BCA)蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程限公司)、視神經(jīng)萎縮癥蛋白1(optic atrophy 1，OPA1)兔多克隆抗體(線粒體融合蛋白1(mitofusin 1，Mfn1)兔多克隆抗體、動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)兔多克隆抗體、細(xì)胞色素C(cytochrome C，CytC)抗體、Caspase-9 抗體、β-actin 兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，p66 Shc抗體(優(yōu)寧維)、活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天)、Trizol細(xì)胞核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script TM RT Master MiX及熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq TM(TaKaRa)均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

32只8周齡的SPF級(jí)雄性SD大鼠(體重180～220 g)由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，分籠飼養(yǎng)于自貢市第一人民醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，室溫保持在(25±2) ℃，濕度保持在(55±5)%，動(dòng)物自由進(jìn)食，自由飲水，保持12 h/d的晝夜循環(huán)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用獲得自貢市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 模型建立及標(biāo)本留取

將32只8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為陰性組、順鉑組、刺芒柄花素+順鉑組和刺芒柄花素組，每組8只。喂養(yǎng)1周后，三組大鼠經(jīng)常規(guī)消毒后一次性腹腔注射順鉑(20 mg/kg)建立AKI模型[9]，順鉑組大鼠血尿素與血肌酐≥陰性組兩倍則為AKI造模成功。陰性組、刺芒柄花素組采用同樣方式注射同等劑量的0.9%生理鹽水。24 h后刺芒柄花素+順鉑組和刺芒柄花素組大鼠行刺芒柄花素(15 mg/Kg)灌胃3 d，陰性組與順鉑組采取相同方式給予等量0.9%生理鹽水生理鹽水。

藥物干預(yù)完成后，禁食禁飲6～8 h，予1%戊巴比妥腹腔麻醉，取各組大鼠腹主動(dòng)脈血液，3 000 rpm離心10 min，收集血清，-80°凍存?zhèn)溆谩o菌條件下處死大鼠，水平位切取2 mm左腎組織并固定在10%的磷酸鹽緩沖福爾馬林液中，用于蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin，HE)染色組織學(xué)檢查；其余腎組織迅速冷凍在液氮中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 腎功能檢測(cè) 各組大鼠的血清樣本均采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中血尿素及血肌酐的表達(dá)水平。

1.4.2 HE染色觀察腎小管損傷 將固定在10%的磷酸鹽緩沖福爾馬林溶液的腎組織經(jīng)脫水、包埋后切片后，進(jìn)行HE染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行半定量分析。組織病理學(xué)的改變由腎小管的損傷的百分比來評(píng)估，腎小管的損傷包括管狀破壞、溶解和鑄型等[9]，組織損傷的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：未見腎小管損傷為0分；受損傷腎小管占總體<25%為1分；受損傷腎小管占總體26%～50%為2分；受損傷腎小管占總體51%～75%為3分；受損傷腎小管占總體76%為4分。

1.4.3 RT-q PCR檢測(cè)mRNA 分別取各組大鼠液氮保存腎臟組織30 mg，采用Trizol法提取組織中的總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。視神經(jīng)萎縮癥蛋白1(optic atrophy 1，OPA1)、線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白(dynamin-related protein 1，Drp1)、p66 Shc、Caspase-9、mfn1、CytC引物由武漢塞維爾生物科技有限公司合成。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，反應(yīng)體系5 μL(5×Prime Script RT Master MiX 2 μL，RNase-free ddH2O 3 μL)，輕柔混勻后進(jìn)行加入DNA擴(kuò)增儀中，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min反轉(zhuǎn)錄，85 ℃ 5 s反轉(zhuǎn)錄酶失活后，4 ℃保存。RT-q PCR檢測(cè)mRNA 反應(yīng)體系20 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10 μL、PCR正反向引物(10 μM)各0.8 μL、 ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、cDNA 2 μL、滅菌蒸餾水6 μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s循環(huán)40次，95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s 融解，50 ℃ 30 s降溫。以β-actin為內(nèi)參，得出ΔCt ，目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量以經(jīng)過處理的樣本相對(duì)于未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)表示，即檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt(ΔΔCt=ΔCt處理樣品-ΔCt未處理樣品)。見表1。

表1 各mRNA引物序列

1.4.4 Western blot檢測(cè)腎組織中的蛋白 取各組大鼠液氮保存腎臟組織100 mg，4 ℃磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)浸洗5 min，2 000 rpm離心10 min，去上清后加入200 μL RIPA 細(xì)胞裂解液與2 μL 蛋白酶抑制劑混勻，4 ℃ 2 000 rpm離心10 min，收集上清大鼠腎臟總蛋白懸液。采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒所取組織中各蛋白的表達(dá)濃度。定量結(jié)束后取蛋白溶液50 μL，行SDS-PAGE電泳(12%或15%)，電泳儀分別按 80 V 20 min，120 V 60 min操作，至溴酚藍(lán)剛達(dá)膠底部立刻關(guān)閉電泳儀。將PVDF膜切成與凝膠同樣大小，置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min。在甲醇中浸泡10 s，隨后在超純水振蕩洗滌5 min。最后置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15 min；轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、PVDF膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、PVDF膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，上壓500 g重物，吸干碳板上多余的液體。接通電源，根據(jù)蛋白量大小，決定轉(zhuǎn)膜需要的電壓和時(shí)間。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出，割取待測(cè)膜條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50 s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后將PVDF膜用PBS反復(fù)洗膜3次，用含10%脫脂奶粉的PBST封閉液室溫封閉1 h，棄封閉液，以5%脫脂奶粉的PBS配制的一抗(p66Shc 1∶5 000；Drp11∶2 000；OPA1 1∶2 000；Mfn11∶2 000；CytC 1∶200；Caspase9 1∶1 000)，4 ℃孵育12 h。回收一抗，加入辣根標(biāo)記二抗(1∶1000)室溫慢搖下孵育1 h，棄二抗，PBST清洗條帶15 min。以β-actin為內(nèi)參，采取ECL發(fā)光試劑盒顯影成像，然后使用Image J 軟件分析各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.5 線粒體ROS含量測(cè)定 依照試劑盒說明，取各組大鼠1 mm3左右的新鮮腎臟組織，采用機(jī)械法收集腎臟組織細(xì)胞懸液。500 rpm離心10 min，去上清液，PBS洗滌兩次，重懸制備單細(xì)胞懸液，加入DCFH-DA(10 μM)，37 ℃孵育30 min；探針標(biāo)記結(jié)束后，1 000 rpm離心10 min，收集單細(xì)胞懸液PBS洗滌兩次后重懸，用酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)熒光水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 刺芒柄花素對(duì)各組大鼠腎功能的影響

與陰性組相比，順鉑組和順鉑+刺芒柄花素組大鼠的血尿素(t=11.937，P<0.001)與血肌酐(t=20.572，P<0.001)的水平上升，且順鉑組>2倍陰性組，表明AKI大鼠造模成功；而刺芒柄花素組大鼠則無明顯變化(t=0.043，P=0.967)。與順鉑組相比，順鉑+刺芒柄花素組大鼠的血尿素(t=2.668，P=0.018)與血肌酐(t=11.403，P<0.001)的水平下降。見圖1。

2.2 刺芒柄花素對(duì)順鉑所致的急性腎損傷大鼠腎組織形態(tài)的影響

與陰性組相比，順鉑組大鼠腎組織出現(xiàn)明顯病理變化，腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管擴(kuò)張，可見管型形成，部分腎小管上皮細(xì)胞脫落及裂解，刷狀緣不完整；刺芒柄花素組大鼠腎組織形態(tài)未見明顯病理變化。與順鉑組相比，順鉑+刺芒柄花素組大鼠腎組織損傷病變較輕，偶見管型，腎小管結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好，腎小管損傷程度評(píng)分有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.099，P=0.290)。見圖2。

2.3 大鼠腎組織OPA1、Drp1、p66 、Caspase-9、mfn1、CytC mRNA表達(dá)量

與陰性組相比，順鉑組大鼠的OPA1、mfn1、CytC mRNA的相對(duì)表達(dá)量均降低(OPA1：t=19.193，P<0.001；mfn1：t=9.186，P<0.001；CytC：t=11.813，P<0.001)，Drp1、p66 Shc、Caspase-9的相對(duì)表達(dá)量均升高(Drp1：t=12.220，P<0.001；p66 Shc：t=6.639，P<0.001；Caspase-9：t=10.748，P<0.001)。與順鉑組相比，順鉑+刺芒柄花素組大鼠OPA1及CytC mRNA相對(duì)表達(dá)量上升(OPA1：t=5.455，P<0.001；CytC：t=4.121，P=0.001)，Drp1、p66 Shc、Caspase-9的相對(duì)表達(dá)量均降低(Drp1：t=5.693，P<0.001；p66 Shc：t=4.689，P<0.001；Caspase-9：t=4.344，P<0.001)，而兩組mfn1相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.569，P=0.139)。見圖3。

2.4 各組大鼠腎組織OPA1、drp1、p66 Shc、Caspase-9、mfn1、CytC蛋白的表達(dá)量

與陰性組相比，順鉑組大鼠的OPA1、mfn1、CytC 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均降低(OPA1：t=14.527，P<0.001；mfn1：t=3.712，P=0.002；CytC：t=13.658，P<0.001)，Drp1、p66 Shc、Caspase-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量均升高(Drp1：t=4.989，P<0.001；p66 Shc：t=5.134，P<0.001；Caspase-9：t=14.632，P<0.001)。與順鉑組相比，順鉑+刺芒柄花素組大鼠OPA1、mfn1、CytC蛋白相對(duì)表達(dá)量上升(OPA1：t=3.436，P=0.004；mfn1：t=2.260，P=0.040；CytC：t=7.187，P<0.001)，Drp1、p66 Shc、Caspase-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量均降低(Drp1：t=3.656，P=0.003；p66 Shc：t=3.071，P=0.008；Caspase-9：t=3.947，P=0.001)。見圖4。

2.5 刺芒柄花素對(duì)順鉑所致急性腎損傷大鼠ROS含量的影響

與陰性組，順鉑組大鼠腎組織細(xì)胞ROS的含量升高(t=17.750，P<0.001)，刺芒柄花素組大鼠腎組織細(xì)胞ROS的含量無明顯差異(t=6.402，P<0.001)；與順鉑組相比，順鉑+刺芒柄花素組大鼠腎組織細(xì)胞ROS的含量下降(t=9.506，P<0.001)。見圖5。

3 討論

急性腎損傷使腎小管上皮細(xì)胞失去細(xì)胞骨架的完整性和細(xì)胞極性[10]，在腹腔注射順鉑建立的急性腎損傷小鼠動(dòng)物模型中可出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張、腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、管型形成、基底膜裸露、刷狀緣消失、上皮細(xì)胞脫落及裂解等病理學(xué)改變[9]。本研究結(jié)果顯示，順鉑組大鼠的血尿素與血肌酐的水平高于陰性組，且順鉑組大鼠腎組織出現(xiàn)較明顯的病理變化，腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管擴(kuò)張，可見管型形成，部分腎小管上皮細(xì)胞脫落及裂解，刷狀緣不完整，表明單次腹腔注射成功誘導(dǎo)大鼠AKI模型。

Drp1為線粒體分裂相關(guān)的蛋白，可與線粒體外膜上的受體線粒體分裂蛋白1結(jié)合介導(dǎo)線粒體分裂，絕大部分分布于胞漿[11-12]。而線粒體融合由OPA1和mfn1、mfn2介導(dǎo)，線粒體內(nèi)容物的融合可有效應(yīng)對(duì)細(xì)胞應(yīng)激時(shí)能量需求的增加[12]。本研究中，順鉑組大鼠OPA1、mfn1表達(dá)均低于陰性組，而Drp1表達(dá)則上升；與順鉑組相比，順鉑+刺芒柄花素組大鼠OPA1、mfn1的表達(dá)量上升，Drp1的表達(dá)量則降低。該結(jié)果表明順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷的作用機(jī)制可能是通過促進(jìn)線粒體的分裂，抑制線粒體的融合，刺芒柄花素的使用可有效抑制線粒體非正常分裂，促進(jìn)線粒體融合，從而修復(fù)腎損傷。且與陰性組相比，順鉑組大鼠CytC表達(dá)下降，p66 Shc、Caspase-9表達(dá)均上升，順鉑組大鼠腎組織細(xì)胞ROS的含量升高；而與順鉑組相比，順鉑+刺芒柄花素組大鼠CytC的表達(dá)量上升，p66 Shc、Caspase-9的表達(dá)量和腎組織細(xì)胞ROS的含量均下降。與Brooks等[12-13]研究結(jié)果一致，線粒體的過度分裂可能是促進(jìn)腎小管細(xì)胞促凋亡因素。而敲除mfn2基因的小鼠腎小管上皮細(xì)胞線粒體融合減少，更易于引發(fā)Bax的激活和CytC的釋放，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡易感性增加[14]。由此可見，抑制線粒體過度分裂以及促進(jìn)線粒體融合是增加細(xì)胞應(yīng)激抵抗力的有效措施。p66 Shc作為細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要蛋白酶之一，在腎組織中可通過介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激延緩了疾病的進(jìn)展，在正常情況下，p66Shc處于失活狀態(tài)，不影響線粒體的功能，但在受到p53、H2O2、葡萄糖等信號(hào)的作用下，胞漿內(nèi)的p66 Shc Ser36 發(fā)生磷酸化，然后被脯氨酰異構(gòu)酶PIN1識(shí)別從而異構(gòu)化，并在蛋白磷酸酶PP2A的作用下去磷酸化后進(jìn)入線粒體，最終在線粒體氧化Cyt C產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)。過量ROS可激活OMA1，促進(jìn)L—OPA1被剪切為S—OPA1，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)碎片化、線粒體嵴重構(gòu)和Cyt C釋放，促使細(xì)胞凋亡[15-16]。線粒體內(nèi)的Cyt C釋放到胞漿中后，可與Caspase 9前體等形成凋亡復(fù)合體，使Caspase 9活化，激活Caspase 3，從而引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17-18]。且與順鉑組相比，順鉑+刺芒柄花素組大鼠的血尿素與血肌酐的水平下降，腎組織損傷與順鉑組相比病變較輕，偶見管型，腎小管結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好，表明刺芒柄花素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷具有一定的保護(hù)作用，可減輕順鉑所導(dǎo)致的腎小管及細(xì)胞線粒體損傷。因此推測(cè)刺芒柄花素對(duì)順鉑所致的急性腎損傷大鼠的保護(hù)機(jī)制可能為抑制線粒體的非正常分裂促進(jìn)損傷腎臟細(xì)胞線粒體的融合，同時(shí)阻礙p66Shc的活化，從而減少CytC的釋放，避免其與Caspase 9前體結(jié)合活化激活Caspase 3，從而減少ROS的生成，抑制線粒體結(jié)構(gòu)的破壞和細(xì)胞的凋亡，最終降低腎小管細(xì)胞受損的程度，保護(hù)腎損傷的組織。

綜上所述，刺芒柄花素對(duì)順鉑所致的急性腎損傷大鼠具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)線粒體分裂，抑制ROS的產(chǎn)生進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。