肝纖維化病理過(guò)程中肝組織蛋白酪氨酸磷酸酶SHP1的動(dòng)態(tài)表達(dá)

靳麗敏，郝禮森，劉玉齡，楊小師，展宗媛，陳盼盼，苗笑佳，何宇

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 唐山 063000；2.邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 邢臺(tái) 054000)

含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 1，SHP1)是酪氨酸磷酸酶家族的重要成員，主要表達(dá)于造血細(xì)胞，可負(fù)性調(diào)控其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是造血系統(tǒng)的抑癌因子[1-3]。研究[4-6]顯示，SHP1不僅表達(dá)于造血細(xì)胞，也表達(dá)于一些非造血細(xì)胞如上皮細(xì)胞、脊髓神經(jīng)元、肝細(xì)胞等，其表達(dá)缺失或低表達(dá)不僅參與了造血系統(tǒng)腫瘤及一些實(shí)體腫瘤的形成及發(fā)展，也在某些非腫瘤性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞SHP1在調(diào)節(jié)肝臟炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、白細(xì)胞介素6及腫瘤壞死因子α等炎癥因子減輕小鼠脂肪性肝炎；另有研究[8]發(fā)現(xiàn)，在小鼠肝纖維化模型及慢性乙型病毒性肝炎患者的纖維化肝組織中SHP1蛋白均主要分布于纖維化區(qū)域，提示在肝纖維化病理過(guò)程中肝組織中SHP1的分布發(fā)生了變化，但有關(guān)肝纖維病理過(guò)程中肝組織的SHP1蛋白及mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)仍不清楚。本研究采用腹腔注射四氯化碳法建立大鼠肝纖維化模型，檢測(cè)了大鼠肝纖維化過(guò)程中肝組織SHP1蛋白及 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

50只健康雄性 SD大鼠(清潔級(jí)，體重350～400 g)購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司。小鼠抗3-磷酸甘油醛脫氫酶 (glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)單克隆抗體購(gòu)自arigo公司(臺(tái)灣)；兔抗SHP1單克隆抗體購(gòu)于BioWorld公司(美國(guó))。本研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝纖維化模型的建立 隨機(jī)將50只SD大鼠分為對(duì)照組(n=10)和模型組(n=40)。模型組大鼠腹腔注射50%的四氯化碳橄欖油混合液，1 mL/kg，2 次/周，共8周[9-10]，并于造模2、4、6、8周分別取10只大鼠，無(wú)菌條件下麻醉后取適量肝組織用4%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學(xué)、Masson三色及HE染色，另取適量大鼠肝組織保存于-80 ℃，Western blot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)；對(duì)照組大鼠按模型組方法注射，肝組織標(biāo)本按上述方法同8周模型組大鼠一同留取。

1.2.2 大鼠肝組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)染色 取出多聚甲醛固定的大鼠肝組織，用石蠟常規(guī)包埋后，做成5 μm的連續(xù)切片， Masson三色及HE染色檢測(cè)大鼠肝組織病理學(xué)變化。應(yīng)用SP法進(jìn)行SHP1免疫組織化學(xué)染色，用PBS代替一抗進(jìn)行陰性對(duì)照染色，棕褐色為SHP陽(yáng)性表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色圖像應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，平均光密度值 (mean optical density，MOD) 被用于表示SHP1陽(yáng)性表達(dá)水平。

1.2.3 Western blot分析 取適量于-80 ℃保存的大鼠肝組織提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定蛋白含量后應(yīng)用Western blot技術(shù)分析大鼠肝組織的SHP1蛋白表達(dá)，一抗為兔抗SHP1單克隆抗體(1∶100稀釋)、小鼠抗GAPDH 單克隆抗體(1∶5 000 稀釋 )，二抗為山羊抗兔IgG及山羊抗小鼠IgG(均1∶5 000稀釋 )，檢測(cè)結(jié)果用Image J圖像軟件分析，SHP1蛋白與GAPDH蛋白的積分光密度值比值(相對(duì)積分光密度值)表示SHP1蛋白表達(dá)量。

1.2.4 Real-time PCR 用Trizoi試劑提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物由invitrogen有限公司合成。內(nèi)參基因GAPDH引物：上游5′-GGC AAG TTC AAC GGC ACA G-3′，下游5′-CGC CAG TAG ACT CCA CGA CAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物122 bp；SHP1引物：上游5′-ATC AAC CAG CGG CAG GAA AGT TTG-3′，下游5′-ATC AAT GAT GAT GAT GGT GCC CGT-3′， 擴(kuò)增產(chǎn)物96 bp。在 ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀上實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。各組大鼠肝組織的SHP1 mRNA表達(dá)差異應(yīng)用相對(duì)定量2-△△Ct法比較[11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理組織學(xué)變化比較

對(duì)照組大鼠肝臟質(zhì)地柔軟，表面光滑細(xì)膩；模型組大鼠隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，其肝臟質(zhì)地逐漸變硬，肝臟表面出現(xiàn)細(xì)顆粒狀并逐漸出現(xiàn)堅(jiān)硬小結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)周?chē)换野咨Y(jié)締組織間隔包繞。Masson三色及HE染色顯示四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型成功構(gòu)建；在造模過(guò)程中，大鼠肝纖維化逐漸加重，正常肝細(xì)胞因出現(xiàn)變性壞死而逐漸減少。見(jiàn)圖1及圖2。

2.2 各組大鼠肝組織SHP1定位及分布比較

免疫組織化學(xué)染色顯示，對(duì)照組大鼠肝組織表達(dá)少量SHP1，主要位于細(xì)胞漿；模型組大鼠肝組織，隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)其SHP1表達(dá)逐漸增多，主要分布于纖維化區(qū)域、匯管區(qū)，但其亞細(xì)胞分布沒(méi)有變化。模型組大鼠肝組織在2、4、6、8周的SHP1陽(yáng)性表達(dá)MOD(0.11±0.01、0.14±0.01、0.16±0.01、0.19±0.01)均較對(duì)照組(0.08±0.01)升高(P<0.05)，且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加(P< 0.05)。見(jiàn)圖3。

2.3 各組大鼠肝組織SHP1蛋白表達(dá)比較

Western blot分析顯示，模型組大鼠肝組織在2、4、6、8周的SHP1蛋白表達(dá)(0.53±0.04、0.73±0.04、0.87±0.03、1.10±0.07)均較對(duì)照組(0.35±0.07)升高(P<0.05)，且隨著肝纖維化的加重逐漸上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.4 各組大鼠肝組織SHP1 mRNA表達(dá)比較

Real-time PCR檢測(cè)顯示，造模組大鼠造模不同時(shí)間(2、4、6、8周)肝組織SHP1 mRNA表達(dá)均較對(duì)照組升高(P<0.05)，且隨造模時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

3 討論

肝纖維化是肝臟的損傷修復(fù)反應(yīng)，長(zhǎng)期進(jìn)展可演變?yōu)楦斡不痆12-13]。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，靜止的肝星狀細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量細(xì)胞外間質(zhì)，進(jìn)而引起肝纖維化[14-16]。SHP1可負(fù)性調(diào)節(jié)其下游的信號(hào)通路，其表達(dá)缺失或低表達(dá)除在一些實(shí)體腫瘤及造血系統(tǒng)腫瘤的形成及發(fā)展中發(fā)揮重要作用外，也參與了某些非腫瘤性疾病的發(fā)病機(jī)制[4-6]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，在四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化及慢性乙型病毒性肝炎患者的纖維化肝組織中SHP1蛋白均主要分布于纖維化區(qū)域，提示SHP1在纖維化肝組織中的分布出現(xiàn)了改變。

本研究顯示，大鼠纖維化肝組織SHP1蛋白主要分布于纖維化區(qū)域及匯管區(qū)，與上述研究結(jié)果一致。但進(jìn)一步從mRNA及蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大鼠纖維化肝組織的SHP1 mRNA及蛋白表達(dá)均隨著肝纖維化加重逐漸升高(P<0.05)，提示大鼠纖維化肝組織的SHP1不僅分布出現(xiàn)了改變，其表達(dá)在mRNA及蛋白水平上均出現(xiàn)與肝纖維化程度一致的升高。研究[12,17]發(fā)現(xiàn)，體外活化肝星狀細(xì)胞的SHP1過(guò)表達(dá)可抑制其增殖，而在肝纖維化病理過(guò)程中在體 HSC的增殖隨著肝纖維化的加重逐漸加快，以此推斷肝纖維化過(guò)程中肝組織的SHP1表達(dá)應(yīng)逐漸下降而不是逐漸升高。研究[6]證實(shí)，作為肝臟主要細(xì)胞的肝細(xì)胞存在SHP1表達(dá)，本研究也顯示在大鼠肝纖維化病理過(guò)程中，肝細(xì)胞隨著肝纖維化加重逐漸減少，與肝組織SHP1表達(dá)升高也相矛盾。

大鼠肝纖維化過(guò)程中肝組織SHP1逐漸升高，一方面可能與肝臟炎癥反應(yīng)有關(guān)，研究證實(shí)肝細(xì)胞的SHP1參與了肝臟的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)[6]，而肝纖維化過(guò)程中肝臟一直存在炎癥反應(yīng)，可能是肝纖維化過(guò)程中肝臟的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致了其SHP1表達(dá)升高；另一方面也可能與表達(dá)SHP1的在體活化肝星狀細(xì)胞增多有關(guān)，如果表達(dá)SHP1的在體活化肝星狀細(xì)胞增多也可導(dǎo)致肝組織的SHP1表達(dá)增高。已有研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，SHP1磷酸酶活性的發(fā)揮受其分子構(gòu)象調(diào)控，在無(wú)配體結(jié)合時(shí)處于自我抑制狀態(tài)，當(dāng)酪氨酸磷酸化多肽與其結(jié)合后，其構(gòu)象發(fā)生改變，抑制狀態(tài)被解除才具有磷酸酶活性；并且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[8，20]，SHP1的激動(dòng)劑如索拉非尼及其衍生物SC-1和SC-43可通過(guò)激活SHP1的磷酸酶活性而抑制體外活化肝星狀細(xì)胞的增殖。

綜上，肝組織中SHP1表達(dá)雖然升高，但可能處于無(wú)活性狀態(tài)或活性低而對(duì)在體肝星狀細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯影響，具體原因及機(jī)制還需進(jìn)一步研究。