基因工程改造大腸桿菌生產(chǎn)酪氨酸探究

程 岑

(淮南聯(lián)合大學(xué)人文與外國(guó)語(yǔ)學(xué)院， 安徽 淮南 232001)

目前，利用不同的代謝方式來(lái)產(chǎn)L-苯丙氨酸和L-色氨酸產(chǎn)品很多，但很少投資于研究L-酪氨酸產(chǎn)物的發(fā)酵,因此希望通過(guò)對(duì)高產(chǎn)量苯丙氨酸菌株改造得到酪氨酸產(chǎn)量明顯提高的改造菌株。利用Red同源重組技術(shù)敲除pheL、pheA基因可阻斷分支酸到L-phe的生化反應(yīng)，促進(jìn)酪氨酸在大腸桿菌體內(nèi)積累。大腸桿菌pheA基因缺陷株的研究在國(guó)外已取得進(jìn)展，但國(guó)內(nèi)沒(méi)有報(bào)道。Monica M. Olson等人通過(guò)敲除pheA基因(編碼分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶)和其前導(dǎo)序列pheL，將生產(chǎn)苯丙氨酸的大腸桿菌K12菌株改造成酪氨酸，并在tyrA前加上強(qiáng)啟動(dòng)子trc啟動(dòng)子，使得酪氨酸對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到9 %。Ranjan Patnaik等人通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件使酪氨酸的產(chǎn)量達(dá)到55g/l，對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.3(g/g)，是目前發(fā)酵罐培養(yǎng)的最高產(chǎn)量。

一、材料與方法

(一) 實(shí)驗(yàn)材料

1.菌株與質(zhì)粒。Escherichia coli K12、KF；質(zhì)粒pKD46，質(zhì)粒pCRP(提供氯霉素抗性基因)，質(zhì)粒pMD19-T Simple Vector(克隆載體，用于PCR產(chǎn)物TA克隆)，質(zhì)粒pEVC(含λ噬菌體PL和PR啟動(dòng)子)，質(zhì)粒pEVC-GF(具有含有酪氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶基因aroG基因，含λ噬菌體PL和PR啟動(dòng)子)，質(zhì)粒pEVC-GA(具有含有酪氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶基因aroG、tyrA基因)。其中pMD19-T Simple Vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，其他菌株與質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2.主要試劑。EcoRI、BglII、SphI等限制性內(nèi)切酶，λ-EcoT14I digest、DL 2000等DNA Marker，細(xì)菌基因組提取及DNA膠回收試劑盒，Taq、Taq-plus、Pfu等DNA聚合酶以及其他市售分析純化學(xué)試劑。

3.培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基 (pH 7.0)、發(fā)酵MG培養(yǎng)基(pH值7.0)、MG培養(yǎng)基(pH值7.0)。

(二) 方法

1.打靶PCR片段制備。將含有氯霉素抗性基因的質(zhì)粒pCRP經(jīng)酶切線性化后作為模板，擴(kuò)增用于打靶的抗性基因片段，PCR產(chǎn)物切膠回收，用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收純化，最后用無(wú)菌超純水洗脫溶解。

2.電轉(zhuǎn)化。將相應(yīng)擬敲除基因大腸桿菌E.coli k12(含質(zhì)粒pKD46)接種于3 ml LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)中，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；過(guò)夜菌液以0.5 %比例接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，在30 ℃于200 r/m培養(yǎng)至OD600約為0.2；加L-阿拉伯糖到達(dá)終濃度30 mmol/L，37 ℃200 r/m升溫誘導(dǎo)培養(yǎng)1 h；上述50 mL菌液冰中放置10 min后，4 ℃ 12 000 r/min離心2 min收集其菌體；再用50 mL冰冷的超純水重懸洗滌，于4 ℃10 000 r/min離心2 min收集菌體，重復(fù)此步驟3次，最后用300 mL無(wú)菌水重懸；取上述菌體細(xì)胞50 μL，與一定濃度制備好的PCR產(chǎn)物混勻，冰上放置2 min后加入電擊杯進(jìn)行電擊，電擊后立即加入1 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h 30 min；取150 μL涂布于含有相應(yīng)抗性的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)約20 h。

3.敲除菌株的鑒定與篩選。將PCR鑒定正確的重組菌株接種于3 mlLB液體培養(yǎng)基(含氯霉素抗性)中，42 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，稀釋菌液涂布無(wú)抗平板獲得單克隆菌落。質(zhì)粒pKD46為氨芐青霉素抗性而敲除菌株應(yīng)具有相應(yīng)其他篩選抗性，對(duì)分離得到的單菌落分別進(jìn)行氨芐青霉素和相應(yīng)篩選抗性的抗性檢測(cè)，篩選出對(duì)氨芐青霉素敏感而對(duì)相應(yīng)篩選抗性不敏感的單克隆，即為pKD46消除的敲除菌株。

4.目標(biāo)基因的克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建。采用基因組DNA提取試劑盒提取大腸桿菌DH5α基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增tyrA基因，將PCR克隆得到的基因與T載體連接，所用T載體為T(mén)akara公司的pMD19-T Simple Vector，得到重組質(zhì)粒。

5.目的基因與質(zhì)粒的連接及酶切鑒定。用限制性內(nèi)切酶對(duì)目的片段及表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，分別切膠回收目的基因DNA片段和線性化的質(zhì)粒，純化后進(jìn)行粘端連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，篩選陽(yáng)性克隆。

6.菌體濃度的測(cè)定。對(duì)搖瓶培養(yǎng)的菌液，每隔2 h取一次菌樣，將待測(cè)菌液用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，用722 s可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量600 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)制作菌體生長(zhǎng)曲線。

7.分析方法。葡萄糖含量測(cè)定用DNS法(3,5-二硝基水楊酸比色法)；酪氨酸含量測(cè)定用高相液相色譜；普析通用L6高效液相色譜系統(tǒng)；普析通用紫外檢測(cè)器；Diamonsil 5 μm C18 色譜柱(250×4.6 mm)；流動(dòng)相為甲醇-0.25 mmol/L NaH2PO4水溶液(pH3.0，1∶99，v/v)；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm。

二、結(jié)果與討論

(一) 改造大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)狀況

改造后大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。由圖1可知，E.coli K12(tyrA- pheA- pGA1)、E.coli K12(tyrA- pheA- pGA2)、E.coli KF(tyrA- pheA- pGA1)、E.coli KF(tyrA- pheA- pGA2)，基因改造各菌株生長(zhǎng)速度差別明顯，說(shuō)明aroG及tyrA的表達(dá)在此條件下對(duì)菌株的生長(zhǎng)速度有明顯影響；E.coli K12(tyrA- pheA- pGA1)、E.coli KF(tyrA- pheA- pGA1)比E.coli K12(tyrA- pheA- pGA2)和E.coli KF(tyrA- pheA- pGA2)生長(zhǎng)狀況好，說(shuō)明tyrA基因第357位點(diǎn)的突變對(duì)菌株生長(zhǎng)速度可能有一定的影響。

(二) 改造大腸桿菌菌株對(duì)葡萄糖的利用情況

菌體對(duì)葡萄糖的吸收能力對(duì)菌體生長(zhǎng)有至關(guān)重要的影響，生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基葡萄糖濃度變化如圖2所示。從圖2中可看到，E.coli K12(tyrA- pheA- pGA1)、E.coli K12(tyrA- pheA- pGA2)、E.coli KF(tyrA- pheA- pGA1)、E.coli KF(tyrA- pheA- pGA2)對(duì)葡萄糖的利用情況基本相同，最終的葡萄糖消耗量也是基本相等的，基本上24 h消耗殆盡，其中相比E.coli K12(tyrA- pheA- pGA2)葡萄糖的剩余量多一些。

圖1 大腸桿菌酪氨酸代謝途徑改造

圖2 大腸桿菌基因改造缺陷菌株

(三) 改造大腸桿菌菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)果

將表達(dá)酪氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶基因aroG和tyrAfbr及aroG和tyrAWT的質(zhì)粒pGA1、pGA2分別轉(zhuǎn)化入E.coli K12和KF中，其均含λ噬菌體PR啟動(dòng)子，故采用39 ℃誘導(dǎo)表達(dá)，在補(bǔ)加葡萄糖濃度為2 g/L的MG培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，四個(gè)敲除菌株都有一定酪氨酸產(chǎn)量積累，代謝途徑改造有利于酪氨酸的合成，表明基因aroG克隆表達(dá)促進(jìn)了E4P和PEP合成DAHP，使碳硫更多地流入莽草酸途徑及芳香族氨基酸合成途徑，而tyrA的克隆表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)了代謝流更多的流向酪氨酸途徑，從而使酪氨酸在原有菌株基礎(chǔ)上得到更大的積累。但大腸桿菌K12敲除菌株酪氨酸產(chǎn)量與KF菌株相比差別很大，K12改造菌株產(chǎn)酪氨酸的量明顯高于KF，大概是KF菌株的2倍，這與理論推斷不符，有待于進(jìn)一步研究。在第24小時(shí)Tyr對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率(g/g)見(jiàn)表1。

圖3 大腸桿菌酪氨酸基因改造菌株對(duì)酪氨酸生產(chǎn)的影響

表1 Tyr對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率

三、結(jié)論

通過(guò)Red同源重組系統(tǒng)，利用含有氯霉素抗性基因和目標(biāo)基因同源臂的打靶片段，成功敲除了酪氨酸代謝途徑的的關(guān)鍵酶基因pheL和pheA，在已有菌株E.coli K12和E.coli KF的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步得到E.coli K12 pheL- pheA-菌株和E.coli KF pheL- pheA-菌株。通過(guò)PCR方法克隆得到DAHP合成酶的基因aroG和編碼分支酸酶/預(yù)苯酸脫氫酶的tyrA基因，將其構(gòu)建進(jìn)入質(zhì)粒pEVC，得到表達(dá)載體pEVC-aroG-tyrA(簡(jiǎn)稱(chēng)pGA)，將pGA分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入上述得到的E.coli K12 pheL- pheA-菌株和E.coli KF pheL- pheA-菌株中，使酪氨酸產(chǎn)量得到提高。在以補(bǔ)加葡萄糖為碳源的MG培養(yǎng)基中，四個(gè)菌株的生長(zhǎng)狀況差別較大，其中含pGA1質(zhì)粒的菌株比含pGA2質(zhì)粒的菌株生長(zhǎng)狀況好。四個(gè)菌株葡萄糖的利用情況基本相同。利用得到的E.coli K12(tyrA- pheA- pGA)菌株生產(chǎn)酪氨酸，酪氨酸產(chǎn)量明顯高于E.coli KF(tyrA- pheA- pGA)菌株，約為E.coli KF(tyrA- pheA- pGA)菌株的2倍，E.coli K12菌株可更好地用于酪氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)，在此基礎(chǔ)上，對(duì)酪氨酸代謝途徑上游關(guān)鍵基因進(jìn)行更合理的改造，有望實(shí)現(xiàn)酪氨酸的低成本工業(yè)生產(chǎn)。