恒溫隔絕式聚合酶鏈式反應檢測食品中金黃色葡萄球菌

李傳友，曾寶鋒，趙燕英，湯 承，陳 娟，劉 驥，朱成林，曾英杰，于基成，唐俊妮,*

（1.西南民族大學食品科學與技術學院，四川 成都 610041；2.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041；3.大連民族大學 生物技術與資源利用教育部重點實驗室，沈陽 大連 116600）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）廣泛存在于自然界，是一種常見的食源性致病微生物[1]。其容易污染食物并在食物上生長產生具有毒性的腸毒素物質（Staphylococcal enterotoxins，SEs），如SEA、SEB、SED等經常引發食物中毒，威脅著食品安全[2-3]。人體是金黃色葡萄球菌的天然宿主，30%～50%健康人體的鼻腔中定植有金黃色葡萄球菌[4]，因此，食品從生產加工到最終的銷售環節都有被污染的可能。每年因金黃色葡萄球菌污染食物而引發的食物中毒事件時有發生，如陳永正等[5]對一起幼兒園食物中毒事件展開調查，發現該起食物中毒事件由金黃色葡萄球菌A型腸毒素引起；熊玉華等[6]對一家自助餐廳的食材進行檢測，發現從不同食材中都能分離出金黃色葡萄球菌。

目前，金黃色葡萄球菌的常用檢測方法主要有傳統培養法、免疫學方法和分子生物學檢測方法等[7-9]。其中傳統檢測方法和免疫學方法都存在耗時長，操作繁瑣等缺點[10]。分子生物學作為最常用的一種檢測方法，具有特異性好、靈敏度高等優點，已經廣泛用于金黃色葡萄球菌的檢測中[11]。

恒溫隔絕式聚合酶鏈式反應（insulated isothermal polymerase chain reaction，iiPCR）是一種新型熒光PCR技術，它是根據Rayleigh-Benard對流原理，通過反應管底部液體持續加熱產生上部液體與下部液體的溫度差，通過控制散熱的速率與對流的時間，在反應管內部形成穩定溫度梯度，從而提供PCR擴增所需的反應條件[12]。該技術最早在2002年，由Krishnan首次報道[13]，結合POCKITTM系列手持式核酸檢測儀，體積小、自帶電源，加樣后一鍵操作，反應僅需42 min便可完成，結果以“+”、“-”、“?”直接顯示于液晶屏幕上，方便快捷，可達到現場快速檢測的目的。目前iiPCR技術主要用于病毒檢測，如豬流行性腹瀉病毒[14]、牛冠狀病毒[15]、蝦白斑病病毒[16]、尖孢鐮刀菌[17]、滑膜支原體[18]等；而針對細菌的檢測報道較少，僅有無乳鏈球菌[19]和沙門氏菌[20]的相關報道。因此，本研究擬建立一種基于iiPCR技術快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，并進行方法的比較和初步應用，以期為后期進一步推廣應用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌ATCC6538作為參考菌株，其他菌株：豬鏈球菌II型、大腸桿菌ATCC25922、蠟樣芽孢桿菌ATCC11778、單核細胞性李斯特菌ATCC19115、副溶血弧菌ATCC17802、阪崎腸桿菌ATCC29544、志賀菌ATCC12022、沙門氏菌H9812均由本實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker（BP）瓊脂基礎、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（trypticase soy broth，TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）、1%亞碲酸鉀卵黃增菌液 海博生物技術有限公司；DL2000 Marker、TaqPCR Mix預混液（2X含藍染料） 北京擎科新業生物技術有限公司；氯化鈉 天津市致遠化學試劑有限公司；G-10電泳瓊脂糖凝膠 西班牙Biowest公司；Tris-HCl、EDTA 北京博奧拓科技有限責任公司；Premix ExTaq（Probe qPCR）、TB Green Premix ExTaqII、核酸染料GELVIEW 寶生物工程（大連）有限公司。

CFX96熒光定量PCR儀、VerSaDoc2000凝膠成像系統美國Bio-Rad有限公司；TSNENEN031445 PCR儀基因（美國）有限公司；POCKITTM小型智能型核酸分析儀、R-tube（48） 廈門金瑞鴻捷生物科技有限公司；SC-15數控超級恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司；5804R型冷凍離心機 Eppendorf生命科技公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；WD800B型微波爐 順德市格蘭仕微波爐電器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 引物及探針的設計與合成

選取金黃色葡萄球菌的nuc基因作為目標基因，利用Primer Premier 5軟件設計一對引物及探針，并對引物與探針進行BLAST比對。另一對常規PCR引物參考唐俊妮等[21]的引物，詳細引物信息見表1。引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物、探針基本信息Table 1 Sequences of primers and probes used in this study

1.3.2 模板DNA的提取

參考酚-氯仿提取法[22]、水浴提取法[23]、微波提取法[24]提取模板DNA，并對3種方法的擴增效果進行對比。

1.3.3 iiPCR反應體系的探索

參考李凡等[15]建立的牛冠狀病毒iiPCR方法。采用25 μL體系分別對已知濃度的Taq酶（預混酶）5 U/μL（11～13.5 μL）上下游引物10 μmol/μL（0.5～2 μL）、探針10 μmol/μL（0.25～1 μL）、模板DNA（1～4 μL）、無菌水的用量進行條件探索，確定各自用量的最佳值。

1.3.4 特異性實驗

采用上述擴增體系，結合POCKITTM手持式核酸分析儀對提取的金黃色葡萄球菌、單核細胞性李斯特菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、豬鏈球菌、阪崎腸桿菌、志賀菌的模板DNA進行檢測，以判定該方法的特異性。

1.3.5 靈敏性實驗

將純培養的金黃色葡萄球菌菌液通過10 倍稀釋成不同的濃度梯度（100～10-10），提取各個濃度模板DNA采用上述體系并結合POCKITTM手持式核酸分析儀進行檢測，確定其檢出限。

1.3.6 穩定性實驗

參考謝國駟等[25]的方法，采用上述擴增體系并結合POCKITTM手持式核酸分析儀分別對純培養菌液的3個稀釋度（10-6、10-7、10-8）提取的模板DNA進行3 次重復性實驗，以評價該方法的穩定性。

1.3.7 人工模擬污染食物樣品的檢測

將起始接種總數量為100 個CFU的金黃色葡萄球菌分別接種到250 mL的脫脂牛奶和10 g豬肉中進行培養，之后在細菌生長過程中的第2、4、6、8小時進行取樣，同時采用傳統PCR方法和iiPCR方法進行檢測，對比其檢測結果。傳統PCR體系及反應條件：TaqPCR Mix預混液（2X，含藍染料）10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、模板DNA 1 μL、無菌超純水補足至20 μL體系；反應擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。產物于4 ℃保存或進行凝膠電泳檢測。產物的瓊脂糖電泳檢測：配制瓊脂糖凝膠為1 g/100 mL，取4.5 μL擴增產物進行點樣，90 V、72 A條件下電泳40 min，在凝膠成像系統下觀察結果。

1.3.8 采集實際食物樣品

市場上采集20 份食品樣品，每份10 g直接分裝至7.5%氯化鈉肉湯中富集培養，采用傳統PCR方法、iiPCR方法對樣品進行檢測，同時根據GB 4789.10—2016《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》對檢測結果進行驗證[26]。

表2 樣品采集信息Table 2 Information about samples collected in this study

2 結果與分析

2.1 模板DNA提取方法的比較結果

采用酚-氯仿提取法、水浴提取法、微波提取法提取DNA的PCR擴增結果見圖1。3種方法都能擴增出目的條帶，但考慮到酚-氯仿提取法所使用試劑有毒，所耗時間長；微波提取法對微波爐功率有一定要求；而水浴法操作簡便，因此，本研究選擇水浴法作為細菌DNA提取的方法。

圖1 模板DNA提取方法擴增產物的比較Fig. 1 Comparison of PCR-amplified products of template DNA extracted by different methods

2.2 iiPCR體系的探索結果

經過篩選確定，摸索出iiPCR最終反應體系：5 U/μLTaq酶（預混酶）12.5 μL，10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，10 μmol/μL探針0.5 μL，模板2 μL，補足無菌水至25 μL。

2.3 iiPCR的特異性實驗結果

將金黃色葡萄球菌、單核細胞性李斯特菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、豬鏈球菌、阪崎腸桿菌、志賀菌的DNA按上述擴增體系進行擴增，結果見圖2，圖中POCKITTM手持式核酸分析儀界面上顯示只有金黃色葡萄球菌檢出為陽性結果（+），陰性對照和單核細胞性李斯特菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、豬鏈球菌、阪崎腸桿菌、志賀菌均檢出為陰性（-）。表示針對金黃色葡萄球菌所建立的iiPCR檢測方法特異性良好。

圖2 iiPCR特異性實驗Fig. 2 Specificity evaluation of iiPCR

2.4 iiPCR的敏感性實驗結果

將純培養濃度為109CFU/mL金黃色葡萄球菌菌液，通過梯度稀釋培養液，然后采用上述擴增體系對不同稀釋濃度的培養液進行檢測，結果見圖3，可以看出，POCKITTM手持式核酸分析儀界面上陰性對照和濃度為10 CFU/mL時顯示為陰性（-），濃度為103CFU/mL和102CFU/mL顯示為陽性（+），說明建立的iiPCR檢測方法對金黃色葡萄球菌純培養液的檢出限為102CFU/mL。

圖3 iiPCR敏感性實驗Fig. 3 Sensitivity evaluation of iiPCR

2.5 iiPCR的穩定性實驗結果

采用本研究建立的iiPCR方法對3個稀釋度（10-6、10-7、10-8CFU/mL）的模板DNA分別進行3 次重復性檢測，從圖4可看出，POCKITTM手持式核酸分析儀界面上10-6CFU/mL和10-7CFU/mL顯示為陽性（+），10-8CFU/mL和陰性對照顯示為陰性（-），3 次重復檢測結果一致，表示所建立的iiPCR方法穩定性良好。

圖4 iiPCR穩定性實驗Fig. 4 Stability evaluation of iiPCR

2.6 人工模擬污染食物樣品的檢測結果

2.6.1 豬肉樣品的檢測結果

對豬肉中培養至第2、4、6、8小時的樣品進行檢測，結果見圖5。在培養至第2、4小時，傳統PCR方法和iiPCR方法均不能檢測出樣品；培養至第6小時，豬肉樣品中的金黃色葡萄球菌數量約為1 000 CFU/mL，建立的iiPCR方法可以得到檢測結果為陽性，傳統PCR方法檢測結果為陰性。在培養至第8小時，傳統PCR方法和iiPCR方法均能得到陽性檢測結果，此時金黃色葡萄球菌數量約為105CFU/mL。

圖5 豬肉樣品檢測結果Fig. 5 Results of iiPCR and traditional PCR for pork samples

2.6.2 脫脂牛奶樣品的檢測結果

對脫脂牛奶中培養至第2、4、6、8小時樣品進行檢測，結果見圖6。培養至第2、4小時，傳統PCR方法和iiPCR方法均不能檢測出陽性結果；培養至第6小時，脫脂牛奶樣品中的金黃色葡萄球菌數量約為100 CFU/mL，建立的iiPCR方法可檢測出陽性結果，傳統PCR方法檢測結果為陰性。培養至第8小時，傳統PCR方法和iiPCR方法均能得到陽性檢測結果，此時金黃色葡萄球菌數量約為105CFU/mL。

圖6 脫脂牛奶樣品檢測結果Fig. 6 Results of iiPCR and traditional PCR for skim milk samples

2.7 實際采集食物樣品的檢測結果

2.7.1 實際樣品檢出結果

采用建立的iiPCR方法對采集的20 份實際樣品進行檢測，在培養至第6小時iiPCR方法擴增結果見圖7，可看出此時iiPCR方法可對17 份樣品檢出陽性結果，6號、8號和18號樣品未檢出，檢出率為85%（17/20）。

圖7 建立的iiPCR在培養至第6小時檢測食品樣品的結果Fig. 7 Results of iiPCR for food samples at 6 h

2.7.2 iiPCR方法與其他檢出方法的比較

采用建立的iiPCR方法、傳統PCR方法以及傳統培養法對采集樣品檢出結果進行比較，結果見表3。在培養至第8小時傳統PCR方法擴增結果見圖8，可看出此時傳統PCR方法只能對14 份樣品檢出陽性結果，檢出率為70%，3、6、8、10、17、18號樣品未能檢出。進一步對未檢出樣品進行培養，直到培養至第12小時，傳統PCR方法才可對3、10、17號樣品檢出陽性，結果見圖9。同時根據GB 4789.10—2016對培養至第16小時的樣品進行分離鑒定，部分結果見圖10，所有能檢出的陽性樣品在BP瓊脂上均能生長出金黃色葡萄球菌的典型菌落形態，菌落呈灰黑色、周圍有淺白色的邊緣并繞以不透明圈，其外有一清晰帶，通過鏡檢染色進一步鑒定，并同時進行PCR確認，結果見圖11，除6、8、18號樣品檢測為陰性，其他17 份樣品檢測均為陽性結果，培養至第6小時iiPCR方法檢測出的結果一致。可見，由本研究建立的金黃色葡萄球菌iiPCR檢測方法耗時更短，且應用于實際食品樣品檢測時，快捷、實用和準確度高。

圖8 傳統PCR檢測食品樣品結果（8 h）Fig. 8 Results of traditional PCR for food samples at 8 h

圖9 食品樣品3、10、17號采用傳統PCR在培養至第6、8、10、12小時的檢出結果Fig. 9 Results of traditional PCR for food samples 3, 10, and 17 at 6, 8, 10 and 12 h

圖10 傳統培養法驗證Fig. 10 Results of validation by traditional culture method

圖11 傳統培養方法分離細菌的PCR鑒定結果Fig. 11 PCR identification results of bacteria isolated by traditional culture method

表3 3種檢測方法的比較結果Table 3 Comparison of results of three detection methods

3 討論與結論

本研究基于iiPCR技術，建立一種適用于快速檢測金黃色葡萄球菌的方法，在縮短檢測時間的同時，提高了工作效率。至今發現的SEs和類腸毒素共有27 種[27-28]，有相關報道認為金黃色葡萄球菌污染食品并產生危害是在生長對數后期或達到生長穩定期時，此時SEs大量產生，造成食物中毒[29-31]。因此，在產生毒素前及時檢測出結果十分必要。本研究建立的iiPCR方法可以滿足這一要求。

本研究在模擬的食物基質檢測表明，含量很低的金黃色葡萄球菌在前4 h生長速度相對較緩慢，而在4 h之后則開始生長加快，建立的方法可從培養6 h人工污染的脫脂牛奶和豬肉中提取出細菌模板DNA，并檢測到金黃色葡萄球菌的存在，而傳統的PCR檢測方法需要更久的培養時間，說明方法的敏感性優于傳統PCR方法；另外發現，金黃色葡萄球菌在脫脂牛奶和豬肉中前8 h的生長速度低于在TSB中的生長速度，可能由于培養基中營養成分的種類和含量比脫脂牛奶和豬肉更適合細菌生長[32]。目前，對于食品中金黃色葡萄球菌的檢測一般都是按照國標方法[26]，首先進行細菌的富集培養，再進行細菌的分離純化，耗時較長，通常需要2～3 d甚至更久才能完成整個檢測過程。本研究探討對食品樣品中金黃色葡萄球菌的iiPCR檢測，通過對樣品進行簡單前處理，只需在7.5%氯化鈉肉湯中富集 6 h后，配合水浴法提取模板DNA，證實建立的iiPCR方法可檢測食品樣品中的金黃色葡萄球菌，說明模板DNA提取探索和方法的建立成功。Tsen等[20]針對雞肉中沙門氏菌檢測，建立了iiPCR方法，并經實驗證明雞肉樣品只需富集5 h，就可利用iiPCR檢測沙門氏菌，本研究的結果也達到了同樣效果。結合POCKITTM系列手持式核酸檢測儀42 min的反應和結果的顯示，省去繁瑣的凝膠電泳過程，大大節省時間。可見，采用的iiPCR技術在目標細菌的富集時間上節省了至少2 h以上，再加上傳統PCR所需的擴增反應時間和凝膠電泳時間，整個檢測時間可縮短至少5 h以上。傳統PCR方法檢測整個流程所需至少12 h甚至更久，而iiPCR方法檢測整個流程可在7～8 h完成，操作更便捷。當然，本研究中也存在一定的不足，未來將擴充菌株的驗證數量，進一步加大該方法的使用和評價。

綜上，本研究建立的一種基于iiPCR技術檢測金黃色葡萄球菌的方法，對方法進行初步應用，證明該方法具有靈敏度高、特異性好、穩定性好的特點。將該方法結合水浴法快速提取模板DNA以及POCKITTM手持式核酸分析儀，通過設計特異性引物和探針，可實現對金黃色葡萄球菌的現場快速檢測。從目標細菌富集，到模板DNA提取，特異性基因擴增到出現檢測結果，整個過程可在7～8 h完成。相比于傳統PCR檢測方法，至少節省了5～6 h的檢測時間，省去凝膠電泳過程，操作更便捷。