超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測飲用水中N-亞硝胺類消毒副產(chǎn)物

孫 銘，古其會(huì)，張菊梅，郭偉鵬，吳慧清，張友雄，韋獻(xiàn)虎，吳清平,*

（1.中國科學(xué)院廣州化學(xué)研究所，廣東 廣州 510650；2.廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物安全與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

亞硝胺具有“三致”毒性，是水中一類新型含氮消毒副產(chǎn)物，近年來以N-亞硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）為主的N-亞硝胺類消毒副產(chǎn)物在世界各地的水環(huán)境中（飲用水廠、污水處理廠等）頻繁檢測出[1-4]。飲用水作為食品飲料工業(yè)的重要原料，其安全性直接關(guān)系著食品飲料行業(yè)的健康發(fā)展。因此，檢測飲用水中痕量N-亞硝胺，對(duì)評(píng)價(jià)飲用水水質(zhì)，保證食品飲料水源的安全具有重要意義。

飲用水中N-亞硝胺的含量通常較低，因此在檢測前需要進(jìn)行濃縮以降低方法檢出限，提高靈敏度，常用的方法主要有液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）法[5]、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）法[6]和固相萃取法[7-8]。其中，LLE需要大量有機(jī)溶劑，耗時(shí)費(fèi)力。SPME雖然所需水樣少，省時(shí)，但容易受到環(huán)境及操作條件的影響，而且對(duì)低揮發(fā)性的N-亞硝胺回收率和靈敏度較低，僅適用于廢水中N-亞硝胺的檢測[9]。而固相萃取能同時(shí)萃取多種不同性質(zhì)低濃度的目標(biāo)物質(zhì)，可對(duì)大體積樣品進(jìn)行萃取，具有溶劑用量少，濃縮倍數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)[9]。此外，固相萃取還能克服LLE在復(fù)雜基質(zhì)樣品中易乳化的缺點(diǎn)[9]。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[10-13]和氣相色譜結(jié)合熱能分析儀[14]已用于分析N-亞硝胺類物質(zhì)，但主要用于分析揮發(fā)性和熱穩(wěn)定的N-亞硝胺[15-16]。采用帶紫外熒光檢測器的液相色譜和毛細(xì)管電泳方法檢測N-亞硝胺也有報(bào)道，但靈敏度低，無法滿足飲用水中痕量N-亞硝胺的檢測需求[17]。已有文獻(xiàn)報(bào)道[3,18-19]采用電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法能同時(shí)檢測出飲用水中9種N-亞硝胺類消毒副產(chǎn)物，包括NDMA、亞硝基甲基乙胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、亞硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、亞硝基嗎啡（N-nitrosomorpholine，NMOR）、亞硝基二丙胺（N-nitrosodi-n-propylamine，NDPA）、亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、亞硝基二丁胺（N-nitrosodi-n-butylamine，NDBA）、亞硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDPhA）。但N-亞硝胺中的NDMA、NMEA和NDEA分子質(zhì)量較小，ESI對(duì)于這3種物質(zhì)的檢測靈敏度相比于其他6 種偏低，具有一定的局限性。利用大氣壓化學(xué)電離（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）源對(duì)食品中小分子農(nóng)藥殘留[20]和功能物質(zhì)[21]的檢測已取得顯著效果，但在N-亞硝胺的液相色譜-質(zhì)譜檢測方法中鮮見采用APCI離子源進(jìn)行分析[22]。

本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，并考察流動(dòng)相、洗脫劑及定容溶劑對(duì)9種N-亞硝胺類消毒副產(chǎn)物響應(yīng)強(qiáng)度的影響。優(yōu)化樣品前處理及進(jìn)樣條件，采用APCI離子源，建立一種基于超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀同時(shí)檢測飲用水中9種N-亞硝胺的方法。本實(shí)驗(yàn)通過檢測實(shí)際水樣中的痕量N-亞硝胺，驗(yàn)證該方法的適用性，對(duì)于評(píng)價(jià)飲用水水質(zhì)，進(jìn)一步研究去除和控制飲用水中N-亞硝胺，保證食品飲料生產(chǎn)中飲用水安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CNW椰殼活性炭固相萃取小柱（2 g/6 mL） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；SB-C18RRHD色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） Agilent Technologies（上海）公司。

9種N-亞硝胺混標(biāo)（2 000 mg/L甲醇溶液） 美國Supelco公司；NDMA-D6標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg/L甲醇溶液）、NDPA-D14標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg/L二氯甲烷溶液）美國O2si公司；二氯甲烷、甲醇、甲苯、乙腈、甲酸（均為色譜純） Agilent Technologies（上海）公司；碳酸氫鈉、乙酸銨、硫代硫酸鈉、碳酸氫銨（均為分析純）上海麥克林生化科技有限公司；高純氮?dú)猓兌龋?9.9%）廣州市君多氣體有限公司；水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

ExionLC AD /Triple Quad 5500+QTRAP超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國SCIEX公司；HSE-12D固相萃取裝置（配真空泵） 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；MTN-2800D氮吹儀 天津奧特賽恩斯公司。

1.3 方法

1.3.1N-亞硝胺及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以甲醇為溶劑，采用購買的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋得到9種N-亞硝胺及NDMA-D6的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度依次為1、2、5、10、20、50、100 μg/L，另外，NDPA-D14作為定量內(nèi)標(biāo)，其質(zhì)量濃度為20 μg/L。

1.3.2 實(shí)際水樣的采集

取東江某水廠水源水及其供應(yīng)區(qū)域內(nèi)的管網(wǎng)水水樣。針對(duì)管網(wǎng)水進(jìn)行采集的過程中，將質(zhì)量濃度為100 mg/L的硫代硫酸鈉提前加入到棕色的采樣瓶中，以脫去管網(wǎng)水中的余氯。采取的水樣需在低溫、避光條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，2 周內(nèi)完成分析。

1.3.3 樣品處理

采用固相萃取法對(duì)樣本進(jìn)行處理，在使用固相萃取小柱萃取之前，依次用6 mL二氯甲烷、12 mL甲醇和超純水15 mL活化小柱。水樣的pH值用碳酸氫鈉將其調(diào)節(jié)至8.0左右，500 mL水樣以3～5 mL/min的速率通過活化后的小柱。水樣上樣完后，在低壓下抽60 min。最后，使用二氯甲烷3×5 mL完成洗脫，洗脫過程中的實(shí)際流速應(yīng)控制在2～3 mL/min范圍內(nèi)，利用氮吹實(shí)現(xiàn)洗脫液的濃縮處理之后，向其中加入超純水定容至0.5 mL，以備進(jìn)樣。

1.3.4 儀器檢測

液相色譜條件：SB-C18RRHD色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相由含有0.2%甲酸的10 mmol/L碳酸氫銨溶液（流動(dòng)相A）和甲醇（流動(dòng)相B）組成，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫40 ℃。流動(dòng)相梯度洗脫程序：0～0.5 min，85% A、15% B；0.5～2.5 min，85%～5% A、15%～95% B；2.5～3.5 min，5% A、95% B；3.5～3.51 min，5%～85% A、95%～15% B；3.51～6.0 min，85% A、15% B。

質(zhì)譜條件：采用APCI正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測。氣簾氣壓力30 psi；離子化電流3 μA；離子源溫度350 ℃；噴霧氣壓力40 psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用高質(zhì)量濃度（1 mg/L）的混標(biāo)溶液，進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，在全掃模式下確定待測物的母離子和最優(yōu)去簇電壓，然后在子離子模式下確定定量和定性子離子及對(duì)應(yīng)的最優(yōu)碰撞能量。優(yōu)化得到9種N-亞硝胺及回收率標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（NDMA-D6）和定量內(nèi)標(biāo)（NDPA-D14）的質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果如表1所示。

表1 9種N-亞硝胺及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of nine N-nitrosamines and internal standard

2.2 流動(dòng)相的選擇

以含0.2%甲酸的10 mmol/L碳酸氫銨溶液和甲醇作為流動(dòng)相時(shí)樣品檢測強(qiáng)度為100%，根據(jù)不同流動(dòng)相條件下相對(duì)強(qiáng)度確定最佳流動(dòng)相。如圖1所示，當(dāng)水-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，NDMA、NMEA和NDEA的相對(duì)強(qiáng)度值小于50%，說明采用該流動(dòng)相，NDMA、NMEA和NDEA的響應(yīng)較差。同樣，當(dāng)采用0.2%甲酸-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，NMEA、NPYR和NDEA的響應(yīng)較差；采用含0.2%甲酸的10 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，NDMA、NMEA和NDBA的響應(yīng)較差。因此，要保證9種N-亞硝胺都能夠有較好的響應(yīng)，在4 種流動(dòng)相中甲醇和含有0.2%甲酸的10 mmol/L碳酸氫銨溶液作為流動(dòng)相是最佳選擇。

圖1 流動(dòng)相對(duì)9種N-亞硝胺相對(duì)強(qiáng)度的影響Fig. 1 Influence of mobile phase composition on relative intensities of nine nitrosamines

2.3 固相萃取材料的選擇

已有報(bào)道[23]不經(jīng)過濃縮預(yù)處理直接進(jìn)樣檢測水中N-亞硝胺，但通常方法檢出限為μg/L級(jí)別，而飲用水中N-亞硝胺質(zhì)量濃度通常為ng/L級(jí)別，另外檢測水源水時(shí)，直接進(jìn)樣會(huì)受到水體復(fù)雜基質(zhì)的干擾，因此需要進(jìn)行凈化、濃縮后進(jìn)樣，才能滿足實(shí)際飲用水的檢測要求。固相萃取是常用于飲用水中N-亞硝胺的預(yù)濃縮方法，據(jù)文獻(xiàn)[7,19,22]報(bào)道，相比其他填料（HLB、Ambersorb572）的固相萃取小柱，EPA521推薦的椰殼活性炭小柱保留效果較好，因此本實(shí)驗(yàn)選擇椰殼活性炭作為固相萃取材料。

2.4 洗脫溶劑的選擇

最終的洗脫溶劑應(yīng)該充分結(jié)合被檢測物質(zhì)的實(shí)際回收率進(jìn)行確定。實(shí)驗(yàn)分別使用二氯甲烷、甲醇和甲苯作為洗脫溶劑，測定其對(duì)9種N-亞硝胺的回收率影響，結(jié)果如圖2所示。二氯甲烷對(duì)9種N-亞硝胺的回收率均較高，所以選擇二氯甲烷作為本研究的洗脫劑。

圖2 洗脫劑對(duì)9種N-亞硝胺回收率的影響Fig. 2 Influence of eluents on recoveries of nine nitrosamines

2.5 定容溶劑的選擇

檢測不同定容溶劑條件下9種N-亞硝胺的相對(duì)強(qiáng)度，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)定容溶劑選擇乙腈的情況下響應(yīng)最差，甲醇和乙腈利于NDBA的響應(yīng)，二氯甲烷利于NDPhA的響應(yīng)，而超純水作為定溶溶劑能夠讓其中絕大多數(shù)N-亞硝胺表現(xiàn)出較高的響應(yīng)強(qiáng)度。因此，在本研究中選擇超純水作為最終定容溶劑。

圖3 定容溶劑對(duì)9種N-亞硝胺相對(duì)強(qiáng)度的影響Fig. 3 Influence of reconstitution solvents on relative intensities of nine nitrosamines

2.6 實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果如表2所示，9種N-亞硝胺及NDMA-D6在0～100 ng/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好線性關(guān)系，并且其相關(guān)系數(shù)在0.996 9～0.999 5之間。根據(jù)3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度確定檢出限，在0.10～0.33 ng/L之間。相關(guān)報(bào)道[7,24]采用ESI離子源進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜檢測水中9種N-亞硝胺時(shí)，對(duì)其中NDMA、NDEA和NMEA這些分子質(zhì)量較小的N-亞硝胺檢出限較低，通常為ng/L，而相關(guān)報(bào)道[22]采用APCI離子源進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜檢測N-亞硝胺時(shí)，這些分子質(zhì)量較小的N-亞硝胺檢出限也為1 ng/L，本實(shí)驗(yàn)中NDMA、NDEA和NMEA的檢出限降低到0.15～0.33 ng/L，低于1 ng/L，相比之前報(bào)道的靈敏度更高，利于檢出水中更低含量的N-亞硝胺。本實(shí)驗(yàn)采用的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，與之前報(bào)道的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[25]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[26]相比，具有檢測時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，可以在6 min內(nèi)同時(shí)檢測水中9種N-亞硝胺。

表2 9種N-亞硝胺的線性方程及其檢出限和定量限Table 2 Linear equations and limits of detection and quantification of nine N-nitrosamines

2.6.2 回收率和精密度的測定

9種N-亞硝胺在源水和管網(wǎng)水中分別加標(biāo)10 ng/L和50 ng/L時(shí)的回收率結(jié)果見表3。除在加標(biāo)質(zhì)量濃度為10 ng/L時(shí)，NDPhA的回收率在70%以下，其余回收率均在70%～130%范圍內(nèi)，滿足EPA521的要求，無明顯基質(zhì)效應(yīng)。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均不大于10%，精密度良好。說明本方法的適用性較好，可以滿足實(shí)際水體中N-亞硝胺的檢測要求。

表3 9種N-亞硝胺的加標(biāo)回收率及RSDTable 3 Recoveries and relative standard deviations of nine N-nitrosamines in spiked samples

2.7 飲用水的檢測

為了驗(yàn)證本方法對(duì)實(shí)際飲用水中9種N-亞硝胺的有效性和適用性，選擇珠江支流東江某水廠水源水（S1～S7）及其供水區(qū)域內(nèi)管網(wǎng)水（T1～T7）進(jìn)行污染調(diào)查，測定水樣中9種N-亞硝胺類化合物含量，結(jié)果如表4所示，9種N-亞硝胺類消毒副產(chǎn)物在源水（S4、S5和S6）3個(gè)水樣和管網(wǎng)水（T2、T3、T4和T6）4個(gè)水樣，共7個(gè)水樣中檢測出N-亞硝胺。共有5 種N-亞硝胺被檢出，分別為NDMA、NDEA、NMOR、NDPA和NDBA，其中NDMA的被檢出頻率最高，每個(gè)被檢出的水樣中都含有NDMA，其質(zhì)量濃度為0.6～5.4 ng/L，這與相關(guān)全國性調(diào)查結(jié)果[27-29]類似。被檢出的N-亞硝胺中NDBA的質(zhì)量濃度最高，Chen Yingjie等[30]在針對(duì)長江中下游流域開展調(diào)查的過程中也得出了相類似的結(jié)論。之前大部分研究主要集中于N-亞硝胺中的NDMA[31-34]，而忽視了除NDMA以外的N-亞硝胺的危害，根據(jù)調(diào)查的結(jié)果可知以后需對(duì)NDBA給予更多的關(guān)注。

表4 實(shí)際水樣檢測結(jié)果Table 4 Results of determination of nine N-nitrosamines in actual water samples ng/L

3 結(jié) 論

本研究采用固相萃取法進(jìn)行前處理，以APCI為離子源，建立水中9種N-亞硝胺的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。與現(xiàn)有N-亞硝胺檢測研究相比，本方法具有靈敏度高、檢測速度快、適用性好的優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足飲用水中N-亞硝胺的檢測需求。該方法的建立可以為系統(tǒng)性識(shí)別和評(píng)估食品飲料生產(chǎn)中N-亞硝胺的風(fēng)險(xiǎn)提供幫助。