新疆地區驢乳源優良乳酸菌發酵劑的篩選及菌株益生特性

楊 博，柏 吉，靳亞梅，王 歡，倪永清,*，李 谞,*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；2.新農乳業有限責任公司，新疆 阿拉爾 843300）

凡是能利用葡萄糖或乳糖產生乳酸的細菌統稱為乳酸菌[1]。乳酸菌能提高食品的營養價值，改善食品風味，增加食品的保藏性和附加值，是天然的防腐劑[2]，被廣泛應用于乳制品、肉制品和蔬菜制品等。

發酵乳制品是原料乳在特定微生物的作用下通過發酵制成的酸性乳制品，其中乳酸菌發酵劑的發酵性能（產酸、產黏、產香和后酸化等）[3]及益生特性（抑菌、抗氧化和免疫調節等）直接影響最終發酵乳制品的質量及風味好壞[4]。目前，發達國家對發酵劑的研究及產業化已經高度成熟[5]。我國具有得天獨厚的微生物資源優勢，開發出具有自主知識產權的優良乳酸菌發酵劑，使發酵劑的制備逐步形成專業化和規模化的工業生產體系，突破發達國家的行業壟斷已是當務之急。

我國新疆地區的畜牧業發達，乳源豐富，該地區少數民族自古就有手工加工和食用發酵乳制品的傳統，特色發酵乳制品大多為自然環境中使用動物原乳發酵而成[6]。研究發現，動物原乳（驢乳、駱駝乳等）和發酵乳制品中蘊藏著豐富的乳酸菌資源[7-9]，是開發野生型優良乳酸菌及潛在益生菌的天然寶庫。雖然發達國家有開發成熟的發酵劑，但由于技術壟斷很難惠及不發達國家，尤其是經濟落后的地區；同時，從消費群體的地域性以及腸道微生態理論出發，從本地食品更容易篩選到適應當地飲食習慣人群的益生性發酵劑[10]，開發這些乳酸菌資源將有助于本地企業研發具有明顯地域特色的功能性食品。

目前，新疆地區驢產業已初具規模，驢乳逐漸成為研究和開發利用的熱點[11]。有研究認為，驢乳的營養價值與人乳相近，尤其是對一些疾病的治療和抗菌活性效果明顯，其營養價值、活性組分和免疫調節作用成為研究熱點[12-14]。研究發現，原乳中蘊含了豐富的乳酸菌資源，但目前國內外報道的大部分乳酸菌發酵劑來自發酵乳品，針對動物原乳篩選的發酵劑報道較少[15]，尤其與其他動物乳相比，關于驢乳源乳酸菌資源的報道更少。本研究從新疆哈密地區采集的驢乳中分離野生乳酸菌菌株，篩選優良的乳酸菌發酵劑，并測試菌株的益生特性，以期為開發我國具有自主知識產權的乳酸菌發酵劑，以及為研發具有地域特色的功能性發酵乳品、推動當地乳品行業發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

15個驢乳樣品來源于新疆哈密地區巴里坤縣的健康母驢。驢的品種均為新疆驢，喂養方式是家庭散養型，飼料主要為苜蓿、青干草和秸稈混合，日產乳約1～2 kg，用處主要是農作、拖貨等。驢乳收集時，并無自動的擠乳設備，由牧民佩戴一次性無菌手套，用75%乙醇溶液浸泡的紗布擦拭母驢乳頭及周圍，并丟棄第1批乳，收集5 mL的驢乳于無菌離心管中，密封和記錄后放入-20 ℃的車載冰箱，在24 h內運回實驗室貯存于-20 ℃冰箱備用。

1.1.2 指示菌

致病性大腸埃希氏菌（CICC 10411）、腸毒素性大腸埃希氏菌（CICC 10421）、出血性大腸埃希氏菌（CICC 21530）、鼠傷寒沙門氏菌（CICC 10420）、單核細胞性李斯特菌（CGMCC 1.9136）、血清型腸炎沙門氏菌（CGMCC 1.10754）、金黃色葡萄球菌（CICC 21600）和標準菌株鼠李糖乳桿菌GG均購自于中國工業微生物菌種保存管理中心。

1.1.3 培養基與試劑

MRS（Man Rogosa Sharpe）肉湯培養基、MRS固體培養基（MRS肉湯添加1.7%的瓊脂）、M17肉湯培養基及M17固體培養基（M17肉湯添加1.7%的瓊脂）參照文獻[16]配制；LB（Luria-Bertani）培養基、蛋白胨酵母葡萄糖（peptone yeast glucose，PYG）培養基、胰蛋白大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養基 海博生物技術有限公司。

鄰苯三酚、濃鹽酸、硫酸亞鐵（均為分析純）北京奧博星生物技術有限責任公司；脫脂乳粉 內蒙古伊利集團有限公司。

1.2 儀器與設備

DG520厭氧培養箱 英國DWS公司；5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；UVmini-1240紫外分光光度計 日本島津公司；TC-512聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Biometra公司；凝膠成像系統 法國Vilber公司；相差顯微鏡上海光密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 驢乳樣品中乳酸菌的分離純化

先將MRS、M17培養基配好滅菌后倒平板，待其凝固，將采集的驢乳樣品使用無菌生理鹽水稀釋，在稀釋梯度為10-3、10-4、10-5的情況下分別吸取100 μL稀釋液于平板上進行涂布，將涂布后的平板放入37 ℃的培養箱中倒置培養36 h[8]。每個平板挑取顏色、大小和形狀均不同的單菌落進行鏡檢，保留細胞形態呈桿狀或球狀的菌落，連續轉接劃線培養3 次后，挑取純的單菌落于MRS培養基上，37 ℃培養24 h，培養物進行革蘭氏染色和接觸酶實驗，從而實現疑似乳酸菌的初步篩選、分離及純化。將疑似乳酸菌活化、富集后，以2%接種量接種到12%滅菌脫脂乳中37 ℃培養，選擇使脫脂乳凝乳完全，表面無乳清析出的菌株保藏至-80 ℃備用。

1.3.2 16S rRNA基因序列分析

將具備凝乳特性的菌株進行分子生物學鑒定，確定其種屬。DNA的提取采用改良后的苯酚-氯仿-玻璃珠法[12]。利用27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）PCR通用引物對菌株進行基因擴增[16]。擴增條件為：35個循環（95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min），72 ℃終延伸10 min。吸取3 μL的PCR產物于1.5 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將余下PCR產物送至上海美吉公司測序。將所測的16S rRNA基因序列提交到GenBank數據庫中，利用BLAST進行序列同源性分析，采用MEGA v.7.0軟件建立發育樹。

1.3.3 優良發酵劑篩選

1.3.3.1 凝乳時間確定、酸度測定及感官評價

菌株活化后，再經生理鹽水洗滌和重懸，按2%接種量轉接至脫脂乳中，37 ℃發酵培養，凝乳后記錄凝乳時間并將其放入4 ℃冰箱冷藏，取冷藏24 h后的樣品進行酸度測定和感官評價，其中酸度測定方法參考文獻[7]。

組織經過培訓的10 名食品專業的學生對樣品的氣味、外觀、質地、口感和喜愛程度5個感官指標進行評價，每個指標均為20 分，具體評價標準參考文獻[17]。

1.3.3.2 菌株產酸能力的測定

將乳酸菌活化后，再經洗滌和重懸后，按2%的接種量轉接至脫脂乳中，37 ℃發酵培養。每隔2 h取樣，測定可滴定酸，連續測定24 h，并作酸度隨時間變化的產酸曲線，酸度測定參考文獻[7]。

1.3.3.3 菌株后酸化能力的測定

將達到發酵終點的樣品在4 ℃冷藏，分別于第1、4、8、12、16、20天取樣測定滴定酸度。酸度測定參考文獻[7]。

1.3.3.4 菌株產香能力的測定

參考蘇媛寧等[18]的方法，測定后熟1 d后發酵乳的雙乙酰和乙醛含量。

1.3.3.5 發酵乳中活菌數的測定

樣品在4 ℃冷藏，分別于第1、4、8、12、16、20天取樣稀釋涂布，利用平板計數法測定活菌數。

1.3.4 菌株益生特性分析

1.3.4.1 模擬胃腸液實驗

模擬胃液的配制：125 mmol/L NaCl、7 mmol/L KCl、45 mmol/L NaHCO3和3 g/L胃蛋白酶，用濃鹽酸調節pH 2.5；模擬腸液的配制：45 mmol/L NaCl、1 g/L胰蛋白酶、3 g/L牛膽鹽，用NaOH溶液調節pH 8.0，所配溶液均過0.22 μm濾膜除菌[19]。

菌株活化后，以1%的接種量接種于液體MRS培養基，37 ℃培養24 h后，3 000×g離心10 min后收集菌體，反復洗滌后重懸，再以1%的接種量接種于模擬胃液中，混勻，37 ℃培養，分別在0、90、180 min取樣進行活菌計數；另吸取1 mL重懸液接種到9 mL模擬腸液中，37 ℃培養，分別在第120分鐘和第240分鐘取樣進行活菌計數。陰性對照為液體MRS培養基，陽性對照為鼠李糖乳桿菌GG。3 次平行，統計結果[20]。

1.3.4.2 抑菌實驗

無細胞發酵上清液（cell-free fermentation supernatant，CFCS）的制備：菌株活化后，以1%接種量接種于液體MRS培養基中，37 ℃培養24 h后，7 500×g離心10 min獲得上清液，過0.45 μm濾膜除菌，pH值調節至6.5，4 ℃保存備用。此外，為確定CFCS中抑菌物質是否含有類細菌素物質，向CFCS中加入1 mg/mL蛋白酶K，37 ℃水浴2 h后，4 ℃保存備用[21]。

抑菌實驗采用牛津杯法[22]。將致病性大腸桿菌（EC1）、腸毒素性大腸桿菌（EC2）、出血性大腸桿菌（EC3）和金黃色葡萄球菌（SA）接種于液體LB培養基中；將血清型腸炎沙門氏菌（SM1）和鼠傷寒沙門氏菌（SM2）接種于液體TSA培養基中；將李斯特菌（LS1）接種于液體PYG培養基中。以上致病菌均在37 ℃培養18 h，各取0.1 mL培養液稀釋，得到濃度約為105～106CFU/mL的稀釋液。分別取0.1 mL菌懸液均勻涂布在對應的培養基表面，于其表面上等距離放入4個牛津杯，其中3個加入0.2 mL CFCS或經蛋白酶處理的CFCS，余下1個加入無菌的MRS培養基（空白對照），4 ℃預擴散6～8 h后，37 ℃培養24 h，測定抑菌圈直徑，每組3個平行，求其均值。

1.3.4.3 藥敏實驗

根據WHO推薦使用的方法[23]，采用K-B紙片擴散法對菌株進行20 種常用抗生素的藥敏實驗。將菌懸液稀釋至107～108CFU/mL，取0.12 mL于MRS固體培養基表面后，涂布均勻，待表面干燥后將抗生素藥片貼于其表面，每個培養基均分貼4個藥片，貼好后37 ℃倒置培養24 h，觀察結果，測量抑菌圈直徑，每種藥片3個平行。

1.3.4.4 抗氧化活性測定

參考Shi Yunjia等[24]方法，略作修改，對菌株進行羥自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧陰離子自由基清除實驗。制備抗氧化活性測定樣品[24]：菌株接種于液體MRS培養基中，37 ℃培養24 h后，9 000×g離心5 min，棄上清液，菌體用無菌水洗滌2 次，再重懸于無菌水中至菌濃度為109CFU/mL。

羥自由基清除實驗：將1 mL 0.75 mmol/L 1,10-鄰菲咯啉溶液、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液、1.5 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖溶液和1 mL 0.01% H2O2溶液混合均勻后，立即加入1 mL CFCS，搖勻后37 ℃反應30 min，測定536 nm波長處吸光度，3 次平行。羥自由基清除率按式（1）計算：

式中：A1為樣品與自由基反應后的溶液吸光度；A0為水代替樣品反應后的溶液吸光度；A2為水代替自由基反應后的溶液吸光度。

DPPH自由基清除實驗：將1 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液和0.8 mL CFCS混合均勻，黑暗下反應30 min，測定517 nm波長處吸光度，3 次平行。DPPH自由基清除率按式（2）計算：

式中：A1為樣品與自由基反應后的溶液吸光度；A0為水代替樣品反應后的溶液吸光度。

超氧陰離子自由基清除實驗：將0.2 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液和0.8 mL CFCS混合均勻，測定320 nm波長處吸光度；再向混合液中加入0.1 mL 3 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻后再次測定320 nm波長處吸光度。超氧陰離子自由基清除率按式（3）計算：

式中：A11為加入鄰苯三酚的溶液吸光度；A12為未加入鄰苯三酚的溶液吸光度；A0為水代替樣品的溶液吸光度。

1.4 數據處理

實驗數據處理采用SPSS 25軟件進行分析，實驗重復3 次，結果以表示，顯著性分析使用Duncan檢驗（P＜0.05，差異顯著）；使用Origin 9.0軟件繪圖，熱圖繪制采用Heml 1.0軟件。

2 結果與分析

2.1 疑似乳酸菌菌株的分離

從15個驢乳樣品中共分離出56 株純培養物，通過肉眼觀察菌落大小、顏色，鏡檢菌落形態為桿狀或球狀，以及革蘭氏陽性和接觸酶陰性確定38 株疑似乳酸菌，其中具有明顯凝乳特性的菌株7 株。

2.2 16S rRNA基因序列分析結果

將7 株菌的16S rRNA部分基因序列提交至GenBank數據庫進行同源性比對，選取相似性高的菌株序列構建的系統發育樹見圖1。可知，HL12-21、HL29-5、HL30-3、HL21-44、HL26-24、HL29-1和HL13-23分別與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）和乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）的親緣關系最近，且序列相似性均高達100%。

圖1 基于16S rRNA基因序列的乳酸菌系統發育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rRNA gene sequence

2.3 優良發酵劑篩選

2.3.1 凝乳時間、酸度及感官評價結果

凝乳時間的長短不僅體現了菌株的生長以及產酸特性，時間太短，則不利于酸乳香味的形成，若時間太長，影響生產成本[25]。由表1可知，7 株菌株的凝乳時間在13 h內，但發酵劑由多種菌制備，可以彌補部分菌株凝乳時間過長的缺陷，所以它們的凝乳時間均在可接受范圍。

表1 7 株菌制備酸乳凝乳時間、酸度及感官評價結果Table 1 Milk coagulation times, acidities and sensory evaluation scores of milks fermented with seven selected strains

7 株菌制備酸乳4 ℃冷藏24 h后酸度在58～85 °T之間（表1），GB 19302—2010《發酵乳》[26]規定酸乳酸度應大于70 °T，雖然菌株HL26-24和HL13-23制備的酸乳酸度低于70 °T，但考慮到后期是復合發酵劑制備酸乳，因此可以彌補2 株菌產酸不足的缺陷。

感官評價是評價酸乳質量、口感和風味等重要指標[27]，對菌株能否用于酸乳的生產至關重要。如表1所示，由菌株HL12-21、HL21-44、HL29-1和HL29-5分別制備的酸乳均色澤良好，呈乳白色，具有酸乳特有的風味，無氣泡，無乳清析出，質地細膩且表面光滑，它們的綜合評分最高；菌株HL30-3制備的酸乳色澤呈微黃色，具有酸乳特有的風味，雖表面有輕微的乳清析出，但質地細膩和無氣泡；菌株HL13-23和HL26-24制備的酸乳色澤呈乳白色，具有酸乳特有的風味但有少許澀味。

2.3.2 產酸能力測定結果

菌株產酸能力是評價發酵劑的一項重要指標，不同菌株產酸能力不同，且產酸強弱會影響發酵乳的口感、風味和質量等，較弱的菌株將失去利用價值[28]。只有產酸速率適中的菌株，才能滿足生產需求。由圖2可看出，在6 h前，所有菌株的產酸速率均增加緩慢，但在6 h后，產酸速率迅速增加，并在18 h后趨于穩定。其中菌株HL30-3產酸速率速率最快，18 h內酸度達到105.38 °T，表明該菌產酸能力最強。在18 h內，菌株HL12-21、HL29-5、HL21-44、HL29-1的酸度分別由24.43、23.84、20.58、19.48 °T增加到84.12、79.28、78.56、76 °T，這4 株菌的產酸速率較快，表明它們產酸能力較強。菌株HL26-24和HL13-23的產酸速率較慢，在18 h后分別達到66、64.85 °T，二者產酸能力較弱，在生產中容易造成產品污染。

圖2 乳酸菌的產酸曲線Fig. 2 Acid production curves of seven LAB strains

2.3.3 后酸化能力測定結果

在貯藏期間，后酸化是影響酸乳感官品質和風味特性的重要因素，過度的產酸將使發酵乳酸度太高，大量乳清析出，降低了產品的貨架期[29]，因此需選后酸化較弱的菌株作為發酵劑。如圖3所示，4 ℃貯藏20 d后，7 株菌的酸度均呈上升的趨勢，其中菌株HL30-3的酸度增加了17 °T，變化最大，后酸化較強，可能造成酸乳品質的下降和縮短貨架期；菌株HL26-24、HL13-23的酸度變化較小，分別增加了4.8、3.27 °T，且它們最終酸度也低于65 °T，可能與菌株自身產酸較低有關；其余4 株菌的酸度增幅一般，在5～8 °T之間，表明除菌株HL30-3外，其余6 株菌具有較好的抗后酸化能力，不會影響酸乳的風味、口感和質地等。

圖3 酸乳冷藏期間酸度的變化Fig. 3 Change in acidity of milks fermented with seven selected strains during cold storage

2.3.4 產香能力測定結果

乙醛和雙乙酰是構成發酵乳典型風味的重要物質，可以依據二者的含量判斷菌株的產香能力[6]。此外，形成香味物質的高峰一般在發酵結束后，但由于多種風味物質相互作用才能得到良好風味，所以需要12～24 h才能完成其產香過程[18]，本實驗的樣品為后熟1 d后的發酵乳。實驗所得雙乙酰標準曲線的方程為Y=0.121 5X+0.023 8（R2=0.999 1，Y為OD335nm，X為雙乙酰質量濃度/（mg/L））。如圖4所示，菌株HL30-3、HL29-5、HL12-21、HL21-44和HL29-1的乙醛質量濃度較高，分別為18.45、17.48、15.38、12.2 mg/L和11.3 mg/L，其余2 株菌均低于10 mg/L，據報道乙醛含量與酸度呈正相關[27]，本實驗結果與之類似；7 株菌的雙乙酰質量濃度較低，在2.28～4.8 mg/L之間，也有研究報道，產生香味物質能力強的菌株，一般雙乙酰的含量較小[7]。除菌株HL13-23外，其余菌株的乙醛和雙乙酰含量的比例均高于3∶1，一般認為乙醛與雙乙酰含量之比大于3∶1時，且乙醛含量越高，酸乳的風味越好[29]，表明菌株HL30-3、HL29-5、HL12-21、HL21-44和HL29-1產香能力較好且制備的酸乳風味較佳，這與感官評價結果類似。

圖4 菌株產香能力測定結果Fig. 4 Determination of aroma-producing capacity of the strains

2.3.5 發酵乳中活菌數分析

有研究表明，發酵乳的活菌數含量高于106CFU/mL才能在人體產生有益作用，也是體現活性乳酸菌制品具有保健功能的重要指標之一[30]。如圖5所示，后熟1d后，所有菌株的活菌數均高于108CFU/mL，在1～4 d內，活菌數達到最高，可能是這些菌在冷藏前期還具有活性能利用乳中的殘糖；隨著貯藏時間的延長，所有菌株的活菌數均呈下降趨勢，這是因為菌株所處介質酸度較高，貯藏溫度低，抑制了它們的生長和繁殖。貯藏20 d后，除菌株HL26-24和HL13-23外，其余5 株菌株的活菌數仍高于106CFU/mL，滿足相應的要求。

圖5 貯藏期間活菌數變化Fig. 5 Changes in viable bacterial count during storage

2.4 菌株益生特性

2.4.1 模擬胃腸液實驗結果

乳酸菌進行模擬胃腸液實驗能更好地反映菌株在胃腸道環境中的存活情況，對胃腸液的耐受性是潛在益生菌的重要特性，菌株在受到胃酸（低pH值）和腸道環境（膽鹽和胰酶）的影響后，保持足夠數量對乳品工業的應用也非常重要[31]。對7 株菌與鼠李糖乳桿菌GG進行模擬胃腸液實驗，結果見表2。菌株在模擬胃液中均能較好地存活，其中HL29-1、HL30-3、HL29-5和鼠李糖乳桿菌GG的存活情況最好，經過180 min處理后的活菌數仍在107CFU/mL以上。此外，相比模擬胃液而言，模擬腸液對菌株的影響更顯著。在模擬腸液中處理120 min后，除HL26-24和鼠李糖乳桿菌GG的活菌數降低至107～108CFU/mL外，其余6 株菌的活菌數在108CFU/mL以上；處理240 min后，活菌數均出現了不同程度的下降，其中HL12-21、HL21-44和HL29-5的活菌數降低至107～108CFU/mL，其余菌的活菌數降低至107CFU/mL以下。因為對低pH值或高膽汁的抗性機制取決于物種和菌株[32]，部分菌株的模擬胃腸液耐受性差異明顯。綜合模擬胃腸液實驗結果，與鼠李糖乳桿菌GG相比，菌株HL12-21、HL13-23、HL21-44、HL30-3和HL29-5能在胃腸道環境中較好地生存。

表2 乳酸菌在模擬胃液和腸液中的活菌計數結果Table 2 Viable counts of lactic acid bacteria when exposed to simulated gastric and intestinal juice lg（CFU/mL）

2.4.2 抑菌實驗結果

乳酸菌所產的抑菌物質較多，如H2O2、有機酸、CO2和細菌素等[33]。本實驗利用經調酸處理的CFCS以及在調酸基礎上加入蛋白酶K的CFCS對致病菌進行抑菌能力的測定，結果見圖6，顏色從藍色到紅色的漸變過程代表了抑菌圈直徑的遞增。經排酸處理后，由熱圖橫向看，相比鼠李糖乳桿菌GG，菌株HL30-3、HL13-23和HL29-5的紅、橙色區域最多且無深藍色區域，表明這3 株菌的抑菌譜較廣及抑菌能力更強；而其余菌株多為藍色區域，表明它們抑菌譜較窄且抑菌能力一般。縱向看，紅、橙色區域主要集中在EC1、EC2、LS1和SA的區域中，表明大部分菌株對致病性、腸毒素性大腸埃希氏菌、單核細胞性李斯特菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑菌能力。

當在調酸基礎上加入蛋白酶K處理后，由圖6可知，菌株HL30-3和HL29-5的大多數顏色區域變為藍色，而其余菌株的顏色區域變化較小。由于抗菌化合物可以競爭性排斥病原體在腸道的生存和表達，且對蛋白酶敏感[21]，因此菌株HL30-3和HL29-5的抑菌作用可能源自發酵過程產生的類細菌素，而其余菌的抑菌作用可能主要源自H2O2和CO2等，且抑菌活性可能依賴于物種和菌株[34]。總體來說，與鼠李糖乳桿菌GG相比，菌株HL30-3、HL13-23和HL29-5抑菌能力強。

圖6 基于抑菌圈直徑對乳酸菌抑菌能力的熱圖分析Fig. 6 Heatmap analysis of anti-pathogen activity of lactic acid bacteria based on the diameters of the zone of inhibition

2.4.3 藥敏實驗結果

益生菌對抗生素的耐受性會對人體安全性產生較大影響[35]。益生菌在拮抗致病菌時，若耐藥性基因轉移到致病菌后，致病菌將產生耐藥性[23]。即使乳酸菌被廣泛認為是安全的，但仍需評估其安全性。選用20 種常見抗生素對8 株菌進行藥敏實驗，結果判定參照CLSI 2015版標準執行，結果見圖7。熱圖通過不同的顏色梯度表示抑菌圈直徑大小，可反映出乳酸菌的抗生素耐藥情況，顏色從紅色到藍色的過程代表抑菌圈直徑的遞減，整體可知，藍色區域主要集中在卡那霉素、阿卡米星、環丙沙星、諾氟沙星、多黏菌素、萬古霉素和替考拉林，表明這7 種抗生素對大部分菌株無抑制作用，表現出耐藥性，菌株對卡那霉素的耐藥性已經在部分研究中報道過，可能是缺乏細胞色素介導的藥物吸收電子傳遞機制和細胞膜的不滲透性造成[21]，對萬古霉素的耐藥性被認為是由于D-Ala-D-lactate取代了存在于肽聚糖中的正常靶標D-Ala-D-Ala[36]，對其他抗生素的耐藥性可能是由于該抗生素在乳酸菌細胞中缺乏靶位。橫向看，菌株HL30-3、HL29-5和鼠李糖乳桿菌GG的大部分區域處在紅、綠色之間，表明大部分抗生素對這3 株菌有抑制作用；菌株HL21-44、HL26-24和HL29-1部分區域處在紅、綠色之間，表明部分抗生素對它們有抑制作用；菌株HL12-21和HL13-23較多區域為藍色，表明它們對較多抗生素產生耐藥性。縱向看，頭孢噻肟、四環素、米諾環素、利福平、氯霉素、紅霉素、克林霉素、羥氨芐青霉素、青霉素、苯唑西林、鏈霉素、氯芐西林、慶大霉素的大部分區域處在紅、綠色之間，即大部分菌株對它們表現敏感或中度敏感，證實了乳酸菌對這些抗生素的耐藥性普遍較低，與相關的研究報道一致[37]；而其余7 種抗生素的大部分區域為藍色，即大部分菌株對它們表現耐藥。

圖7 基于抑菌圈直徑對乳酸菌的抗生素耐藥性的熱圖分析Fig. 7 Heatmap analysis of the antibiotic tolerance of lactic acid bacteria based on the diameters of the zone of inhibition

2.4.4 抗氧化活性測定結果

機體內的羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基等自由基氧化性強，產生的氧化應激反應會導致DNA、蛋白質、小細胞分子等損傷，進而對機體造成氧化損傷[38]。因此，評價菌株的抗氧化活性極其重要。有研究報道，僅通過單一自由基清除率判定菌株的抗氧化活性準確性不高，為提高結果的有效性，可綜合對多種自由基的清除率判定[25]。采用乳酸菌的活細胞懸浮液進行抗氧化活性實驗，結果如圖8所示，菌濃度為109CFU/mL時，8 株菌對3種自由基均有一定的清除能力，清除率均超過10%，表明它們具有一定的抗氧化活性，可能是因為這些菌株的細胞內存在金屬離子Cu2+和Fe2+等天然螯合劑，金屬離子被螯合后，使過氧化反應減緩及細胞表面存在的蛋白質、多糖等化合物具有清除自由基的作用[39-40]。對比3種自由基清除率，8 株菌對超氧陰離子自由基的清除率最高，可能是菌體產生較多的超氧化物歧化酶，而該酶具有清除超氧陰離子自由基的能力[38]。此外，與標準菌株鼠李糖乳桿菌GG相比，菌株HL21-44、HL29-5和HL30-3對3種自由基的清除率均較高且超過30%，表明這3 株菌的抗氧化活性強于對照菌株。抗氧化活性好的菌株可作為潛在的抗氧化菌株應用于功能食品開發，有助于預防和控制氧化應激相關疾病。

圖8 菌株的抗氧化活性Fig. 8 Antioxidant activity of the strains

3 結 論

本研究結合乳酸菌的傳統分離鑒定方法，從新疆哈密地區采集的驢乳中純化分離出38 株疑似乳酸菌，其中7 株菌具有明顯凝乳性能，經16S rRNA基因測序鑒定菌株HL12-21、HL29-5、HL30-3、HL21-44、HL26-24、HL29-1和HL13-23分別為P. acidilactici、P. pentosaceus、E. mundtii、L. plantarum、L. coryniformis、L. curvatus和L. lactis。對7 株菌的凝乳時間、產酸能力、后酸化能力、產香能力、感官特性和冷藏期間活菌數等指標檢測顯示，7 株菌的凝乳時間短，其中菌株HL30-3具有較好的產酸、產香能力，但后酸化過強可能造成酸乳品質的下降和縮短貨架期；菌株HL13-23和HL26-24具有較弱的后酸化，但產酸和產香能力較差，不能滿足實際生產需求；菌株HL12-21、HL29-5、HL21-44和HL29-1具有更好的產酸、產香能力及弱的后酸化，單菌發酵乳的色澤、質地及風味綜合評分最高，且4 ℃貯藏20 d后，活菌數仍保持在106CFU/mL以上，符合優良發酵劑的基本特征。此外，比較了7 株分離菌株和益生菌鼠李糖乳桿菌GG對模擬胃腸液的耐受性，以及抑菌譜、抗生素耐藥、抗氧化活性，結果表明菌株HL29-5和HL30-3對以上益生菌篩選指標表現更優，尤其對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除率最高（超過30%）。本研究表明驢乳是篩選優良乳酸菌發酵劑的良好來源，其中P. pentosaceusHL29-5具有作為益生性發酵劑的潛力，并為后續研發具有地域特色的發酵乳制品提供了菌株資源，為推動當地乳品行業發展奠定了基礎。