牛免疫球蛋白G的體外人源唾液酸化及Fc片段的制備

李天慧，陳春旭,2，陳貴杰，孫 怡，曾曉雄,*

（1.南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095；2.安徽科技學院食品工程學院，安徽 鳳陽 233100）

免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）作為一種重要的免疫活性物質[1]，不僅存在于體液中，也是牛初乳中的主要抗體之一[2]，其主要功能是負責識別、中和以及消除病原體和有毒抗原帶來的危害[3]。IgG由具有可變和恒定結構域的2 條相同重鏈和輕鏈組成[4]，其識別結合功能主要發生在抗原結合片段（Fab）的可變域，而可結晶片段（Fc）的恒定域則與效應分子和細胞的相互作用相關[5]。作為一種糖蛋白，IgG的糖基化結構與其功能緊密相關。IgG的糖基化在其Fab與Fc片段均可以發生，Fc片段包含至少2個保守的N-糖基化位點[1]，而Fab片段存在15%～25%的N-糖基化[6]。IgG的N-糖基化已被證明與疾病的發生和發展密切相關[7-8]。例如，IgG的末端半乳糖和唾液酸含量可作為炎性疾病子宮內膜異位癥診斷的補充參數[9]；改變IgG的糖基化類型可作為治療溶骨性骨質疾病的一種治療手段[10]。此外，并非只有內源性IgG可以參與免疫調節，外源性IgG對人體也有積極作用。Kaneko等[3]發現唾液酸化IgG對于類風濕性關節炎小鼠有良好的治療效果；Pagan等[11]設計并構建了2 種可溶性糖基轉移酶，可在體內將內源性IgG轉化為抗炎介質。本課題組最近的研究發現，完整進入結腸的唾液酸化IgG能夠通過調節菌株共生關系顯著促進成人腸道中雙歧桿菌的增殖[12-13]。因此，作為糖基化結構的一種，唾液酸化IgG有著重要的研究價值。

盡管唾液酸化IgG具有相當大的潛在功能，但僅有5%～10%的IgG的N-糖鏈末端被唾液酸修飾[14]。而且人源與其他動物來源的唾液酸并不相同，人源IgG（human IgG，hIgG）的唾液酸為N-乙酰神經氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac），動物源如牛IgG（bovine IgG，bIgG）中的唾液酸主要為N-羥乙酰神經氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）。有研究表明非人源的唾液酸與某些疾病如癌癥或慢性炎癥有關[15-16]。不僅完整的唾液酸化hIgG有著積極的營養功能，其Fc片段也具備抗炎活性。Fc片段是發揮抗炎作用的主要活性成分[3,11,17-18]，通常利用木瓜蛋白酶酶切IgG并純化制備Fc片段[19-21]。因此，本研究擬通過神經氨酸酶將bIgG中Neu5Gc殘基水解，利用β-1,4-半乳糖基轉移酶（β-1,4-galactosyltransferase，B4GALT1）和α-2,6-唾液酸轉移酶（α-2,6-sialyltransferase，ST6GAL1）提高bIgG的Neu5Ac水平，實現bIgG的hIgG轉化，并使用木瓜蛋白酶及Protein G蛋白柱制備純化hIgG的Fc片段，為后續研究唾液酸化hIgG及其Fc片段的生物活性（如抗炎癥和調節腸道微生物等活性）提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

bIgG 北京索萊寶科技有限公司；神經氨酸酶（50 000 U/mL） 美國NEB公司；B4GALT1、尿苷二磷酸半乳糖（uridine 5’-diphosphogalactose，UDP-Gal）、胞苷一磷酸-N-乙酰神經氨酸（cytidine monophosphospate-sialic acid，CMP-SA） 廣州昂飛美侖生物科技有限公司；ST6GAL1（≥5 U/mg）美國Sigma公司；木瓜蛋白酶（≥2 000 U/mg）生工生物工程（上海）股份有限公司；Protein G蛋白柱上海翌圣生物公司；1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧基苯雙鹽酸鹽（1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene dihydrochloride，DMB）、Neu5Gc、Neu5Ac 上海源葉生物科技有限公司；Fc片段標準品 美國Jackson ImmunoResearch公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、InertSustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 日本島津公司；TSK-gel G4000 PWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm） 日本東曹株式會社；PowPacTM高電流電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 bIgG中唾液酸含量的測定及神經氨酸酶水解條件的優化

1.3.1.1 Neu5Gc、Neu5Ac系列標準溶液的配制

準確稱量Neu5Gc、Neu5Ac標準品各10 mg，分別用超純水溶解并定容至500 mL容量瓶中，配制成質量濃度20 μg/mL的標準母液。吸取標準母液各500 μL配制2 種標準品質量濃度均為10 μg/mL的混合標準母液，梯度稀釋后配制成2 種標準品質量濃度梯度均為0.000 64、0.003 2、0.016、0.08、0.4、2、10 μg/mL的系列Neu5Gc、Neu5Ac標準溶液。

1.3.1.2 bIgG中唾液酸的酸水解優化

根據文獻[20]的方法并作適當修改。稱取一定量bIgG干粉，配制1 mg/mL IgG溶液，取300 mL IgG溶液加入100 μL 0.1 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）或100 μL 2 mol/L乙酸溶液于80 ℃水浴1 h進行唾液酸殘基水解。

1.3.1.3 神經氨酸酶水解bIgG唾液酸殘基條件的優化

根據文獻[3]的方法并作適當修改。對神經氨酸酶水解bIgG唾液酸殘基的反應條件進行優化與選擇。選擇4、20、40、50 mg/mL bIgG，加入170 U/mL神經氨酸酶，反應體系為5.0 mmol/L CaCl2、50.0 mmol/L醋酸鈉的緩沖溶液，pH 7.5，反應48 h。

1.3.1.4 衍生反應

取1.3.1.2節酸水解產物和1.3.1.3節酶水解產物，加入等體積甲醇，并蒸發至干，加300 μL超純水復溶后，加入50 μL DMB衍生液（8 mmol/L DMB、14 mmol/L連二亞硫酸鈉、0.8 mol/Lβ-巰基乙醇、1.5 mol/L冰醋酸）[22]，50 ℃避光反應2.5 h，產物以0.45 μm濾膜過濾，用于HPLC分析。

1.3.1.5 HPLC分析

使用InertSustain C18色譜柱對bIgG中2 種唾液酸進行分離和檢測，柱溫30 ℃，熒光檢測器激發波長373 nm、發射波長448 nm，流動相為V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（超純水）＝7∶8∶85，流速0.9 mL/min，進樣量20 μL。分別以Neu5Gc、Neu5Ac標準溶液質量濃度為橫坐標，相應峰面積為縱坐標繪制標準曲線，根據標準曲線方程計算Neu5Gc、Neu5Ac含量，結果以每毫克bIgG計。

1.3.2 Protein G蛋白柱純化

將唾液酸酶水解后的bIgG經過Protein G抗體純化柱純化去除神經氨酸酶、唾液酸等，首先用5 倍柱體積的pH 7.0 20 mmol/L Na2HPO4緩沖液平衡層析柱，然后將樣品加到平衡好的Protein G柱中，上樣量30.0 mg IgG，保證目的蛋白與樹脂充分接觸，收集流出液；用10～15 倍柱體積的pH 7.0 20 mmol/L Na2HPO4緩沖液清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白；最后使用5～10 倍柱體積的pH 3.0 0.1 mol/L甘氨酸緩沖液進行洗脫，收集洗脫液，即為目的蛋白組分。

1.3.3 體外半乳糖基化和唾液酸糖基化

參考文獻[18,23]報道的方法并作適當修改。反應體系中底物IgG終質量濃度7.5 mg/mL、UDP-Gal終濃度2 mmol/L、CMP-SA終濃度2 mmol/L、B4GALT1和ST6GAL1添加量分別為25 mU/10 mg（以IgG質量計），反應緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含10 mmol/L MgCl2），pH 7.5、37 ℃反應48 h。根據文獻[24-25]的方法，采用反相離子對液相色譜（reversed phase ion-pair chromatography，RPIC）法分析反應產物，流動相為V（0.01 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）-1.45 mmol/L四丁基硫酸氫銨）∶V（乙腈）＝97∶3，色譜柱為Inertsil ODS-3色譜柱，流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm。

1.3.4 Fc片段制備條件的優化

參考Guerrier等[26]報道的方法，對木瓜蛋白酶酶解由bIgG轉化的hIgG制備Fc片段的條件進行優化。

1.3.4.1 半胱氨酸溶液濃度對Fc片段制備的影響

稱取5 份10 mg制備的hIgG溶解于1.0 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（含0.5 mg/mL木瓜蛋白酶，pH 7.0）中，hIgG質量濃度10 mg/mL，再分別加入20.0 μL 0.1 mol/L EDTA溶液（pH 7.0）和終濃度為0、10、20、40、80 mmol/L半胱氨酸溶液，置于37 ℃水浴鍋中酶解4 h，反應結束后加入0.2 mol/L碘乙酰胺溶液100 μL，冰浴0.5 h終止反應。制備5%濃縮膠和12%分離膠，濃縮膠電壓80 V、電泳30 min，分離膠電壓120 V、電泳60 min，隨后對蛋白膠進行染色、脫色等步驟進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.4.2 酶添加量對Fc片段制備的影響

稱取3 份10 mg制備的hIgG分別溶解于1.0 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（其中m（木瓜蛋白酶）∶m（hIgG）分別為0.025、0.05、0.1，pH 7.0）中，hIgG質量濃度為10 mg/mL，再加入20.0 μL 0.1 mol/L EDTA溶液（pH 7.0）和終濃度10.0 mmol/L半胱氨酸溶液，置于37 ℃水浴鍋中酶解4 h，反應結束后加入0.2 mol/L碘乙酰胺溶液100 μL，冰浴0.5 h終止反應。然后按1.3.4.1節步驟進行SDS-PAGE分析。

1.3.4.3 酶解時間對Fc片段制備的影響

稱取4 份10.0 mg制備的hIgG溶解于1.0 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液（含0.5 mg/mL木瓜蛋白酶，pH 7.0）中，hIgG質量濃度為10 mg/mL，再加入20.0 μL 0.1 mol/L EDTA溶液（pH 7.0）和終濃度10.0 mmol/L半胱氨酸溶液，置于37 ℃水浴鍋中分別酶解2、3、4、5 h，反應結束后加入0.2 mol/L碘乙酰胺溶液100 μL，冰浴0.5 h終止反應。然后按1.3.4.1節步驟進行SDS-PAGE分析。

1.3.5 HPLC定量檢測hIgG及其Fc片段

根據文獻[11]報道的方法，使用TSK-gel G4000 PWXL色譜柱，流動相為含0.3 mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，流速0.6 mL/min，柱箱溫度30 ℃，進樣量20 μL，檢測波長280 nm。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 bIgG中唾液酸殘基的含量

圖1 Neu5Gc和Neu5Ac標準品（A）、0.1 mol/L TFA水解樣品（B）、2.0 mol/L乙酸水解樣品（C）、170 U/mL神經氨酸酶水解樣品（D）HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatograms of Neu5Gc and Neu5Ac standards (A),0.1 mol/L TFA-hydrolyzed sample (B), 2.0 mol/L acetic acid-hydrolyzed sample (C), 170 U/mL neuraminidase-hydrolyzed sample (D)

如圖1所示，在15.6 min和20.5 min出現2個峰分別為Neu5Gc和Neu5Ac，不存在明顯拖尾現象，分離效果良好。將2 種唾液酸標準溶液進行DMB衍生反應后進行HPLC檢測，分別以Neu5Gc、Neu5Ac標準溶液質量濃度為橫坐標，相應峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到方程：Neu5Gc：y＝7×106x-11 215（R2＝0.999 9）；Neu5Ac：y＝9×106x+341 812（R2＝0.999 3），在質量濃度0.000 64～10 μg/mL范圍內均線性良好。

圖2 TFA與乙酸水解方式下bIgG中唾液酸含量Fig. 2 Sialic acid contents in bIgG hydrolyzed by TFA or acetic acid

如圖2所示，對比0.1 mol/L TFA和2.0 mol/L乙酸2 種酸水解方式下bIgG中唾液酸殘基的水解情況發現，0.1 mol/L TFA水解更加徹底。當采用0.1 mol/L TFA水解bIgG時，HPLC檢測結果表明，bIgG中Neu5Gc含量為（0.816±0.009）μg/mg，Neu5Ac含量為（0.099±0.003）μg/mg，即1 mol bIgG中所含2 種唾液酸總物質的量為（0.424±0.006）mol，其中n（Neu5Gc）∶n（Neu5Ac）為7.8∶1，Neu5Ac含量遠低于Neu5Gc，說明在bIgG中Neu5Gc是唾液酸最主要的存在形式。Ma Li等[27]檢測得到中國6 家廠商生產的每1 mol靜脈注射人免疫球蛋白的唾液酸化水平為0.875～1.085 mol。表明bIgG的唾液酸化程度低于hIgG的唾液酸化程度。

2.2 神經氨酸酶水解bIgG中唾液酸殘基條件的優化結果

為優化神經氨酸酶水解bIgG中唾液酸殘基條件，固定神經氨酸酶添加量（170 U/mL），當bIgG質量濃度分別為4、20、40、50 mg/mL時，將0.1 mol/L TFA酸水解bIgG得到Neu5Gc的解離率視作100%。由表1可知，當bIgG質量濃度為4 mg/mL時，170 U/mL神經氨酸酶水解bIgG較為徹底，與0.1 mol/L TFA水解效果相當；隨著bIgG質量濃度的升高，解離率下降，這可能是由于當底物bIgG質量濃度超出一定范圍后，酶促反應速率不再增大，產物Neu5Gc物質的量達到一定值，計算所得的Neu5Gc解離效率隨之下降。因此，以4 mg/mL作為神經氨酸酶酶解反應中bIgG質量濃度。利用酶法將Neu5Gc從bIgG末端解離，與酸水解相比，酶水解對底物更加專一，且這一反應能夠在一定程度上降低通過食用動物源食品攝入Neu5Gc造成的致癌等潛在風險[28-30]。

表1 不同bIgG質量濃度的神經氨酸酶水解樣品中Neu5Gc含量Table 1 Neu5Gc contents in neuraminidase-hydrolyzed samples with different bIgG concentrations

2.3 hIgG的合成

為除去神經氨酸酶和游離的唾液酸等雜質的影響，bIgG經酶水解后用Protein G蛋白柱進行純化，純化后樣品再利用B4GALT1、ST6GAL1和供體UDP-Gal、CMP-SA合成hIgG。由于UDP-Gal和CMP-SA被相應的轉移酶將半乳糖和Neu5Ac被轉移至IgG[31-32]，同時產生UDP和CMP，因此利用RPIC檢測UDP和CMP水平，對供體轉移效果進行間接檢測。

圖3 核苷酸與核苷酸糖標準品（A）、體外糖基化后hIgG樣品中游離核苷酸與核苷酸糖（B）的RPIC圖Fig. 3 Reversed-phase ion-pair chromatograms of nucleotide sugars and nucleotide standards (A), and free nucleotides and nucleotide sugars in in vitro glycosylated hIgG samples (B)

表2 核苷酸與核苷酸糖的標準曲線Table 2 Standard curves for nucleotides and nucleotide sugars

表3 反應結束后不同時間點檢測樣品中游離核苷酸與核苷酸糖含量的相對標準偏差Table 3 Relative standard deviations for free nucleotides and nucleotide sugars in samples analyzed at different times after reaction

表4 RPIC法檢測樣品中核苷酸與核苷酸糖含量的精密度、重復性和穩定性結果Table 4 Results of precision, repeatability and stability of RPIC for the determination of nucleotides and nucleotide sugars

由圖3可知，CMP、UDP、CMP-SA、UDP-Gal分別在第14.7、18.6、26.4、30.5分鐘時出峰，分離明顯，標準曲線如表2所示，在0.05～1 mmol/L范圍內線性關系良好。反應結束后不同時間點檢測樣品中游離核苷酸與核苷酸糖的含量，由表3可知，樣品中核苷酸類物質含量檢測結果的相對標準偏差在反應結束后0～3 h內較好，因此實驗樣品應在3 h內進行HPLC測定。此外，方法的精密度和重復性也較好（表4）。在此基礎上，對體外糖基化hIgG樣品中游離核苷酸與核苷酸糖含量進行分析，以增加的游離CMP和UDP物質的量作為轉移糖基的物質的量進行計算，結果表明，平均每分子IgG約增加了8.4個半乳糖殘基和42個唾液酸殘基。唾液酸殘基的轉移效果明顯優于半乳糖殘基的轉移效果，這可能與bIgG中Neu5Gc殘基被水解后，暴露出半乳糖殘基，不利于半乳糖殘基的轉移有關。本實驗利用2 種糖基轉移酶將半乳糖和Neu5Ac轉移至IgG，為制備抗炎癥介質提供了思路。

2.4 酶解hIgG制備Fc片段的條件優化結果

2.4.1 半胱氨酸濃度

木瓜蛋白酶是一種巰基蛋白酶，因此需要還原劑激活蛋白酶以發生反應，但過量的激活劑會將IgG進一步還原為更小的片段[33]。如圖4所示，不添加半胱氨酸的酶解產物與添加半胱氨酸的酶解產物條帶明顯不同，添加半胱氨酸后，F(ab’)2片段（約110 kDa）轉化為Fab片段[33]。隨著半胱氨酸濃度增加，完整的hIgG條帶（150.0 kDa）灰度明顯變淺，說明酶解程度增加。但同時2 條Fc條帶灰度也隨著激活劑半胱氨酸濃度的增加而減小，可能是半胱氨酸的還原作用將雙鏈Fc片段還原為單鏈或更小的片段。當半胱氨酸濃度為20、40、80 mmol/L時，高分子質量Fc片段已不明顯，因此選擇10 mmol/L作為激活劑半胱氨酸的濃度。

圖4 不同半胱氨酸濃度下木瓜蛋白酶水解hIgG產物的非還原SDS-PAGE圖譜Fig. 4 Non-reducing SDS-PAGE profile of hIgG hydrolyzed by papain with different cysteine concentrations

2.4.2 木瓜蛋白酶添加量和酶解時間

由圖5可知，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，hIgG條帶逐漸變淺；隨著酶解效率進一步升高，高分子質量Fc條帶變淺，這可能是由于木瓜蛋白酶作用于次級酶切位點將Fc片段水解為更小的片段。通常認為，木瓜蛋白酶水解IgG分為多個步驟，主要酶切位點位于鉸鏈區，而Fc片段中也存在2個次級酶切位點，分別位于C段第14位和第105位氨基酸殘基處。因此，Fc片段可進一步被水解為3個片段：C端短片段（約3.0 kDa）、包含2個CH3結構域的片段（約21.0 kDa）以及包含2個CH2結構域和鉸鏈區的片段（約28.0 kDa）[34]。由此推測，隨著酶添加量的增加，木瓜蛋白酶作用于Fc片段的次級酶切位點將其水解為更小的片段。因此，選擇m（木瓜蛋白酶）：m（hIgG）為0.05作為木瓜蛋白酶最適添加量，以在保證酶解效率的同時得到較高純度的Fc片段。

圖5 不同酶添加量和酶解時間下木瓜蛋白酶水解hIgG產物的非還原SDS-PAGE圖譜Fig. 5 Non-reducing SDS-PAGE profiles of papain hydrolyzed hIgG products at different enzyme dosages and hydrolysis times

此外，隨著酶解時間的延長，hIgG條帶逐漸變淺，說明hIgG被酶解的更加徹底，但是不同酶解時間2 條Fc片段條帶灰度差異并不明顯，且酶解2 h后，Fc片段條帶已較為明顯，為避免酶解時間過長導致木瓜蛋白酶作用于次級酶切位點使Fc片段被進一步酶解為更小片段或被半胱氨酸還原劑還原成單鏈[35]，因此選擇酶解時間為3 h。

綜合對激活劑半胱氨酸濃度、木瓜蛋白酶添加量和酶解時間的條件優化，最終優化條件為：10 mg/mL hIgG、m（木瓜蛋白酶）∶m（hIgG）＝0.05、10 mmol/L半胱氨酸、2 mmol/L EDTA溶液、pH 7、酶解時間3 h。

2.5 hIgG及其Fc片段得率

圖6 hIgG（A）和hIgG Fc片段（B）的HPLC圖Fig. 6 HPLC chromatograms of hIgG (A) and Fc fragment (B)

表5 hIgG和hIgG Fc片段標準曲線Table 5 Standard curves for hIgG and Fc fragment

采用HPLC方法對hIgG及hIgG Fc片段進行定量分析，如圖6所示，hIgG和hIgG Fc片段的保留時間分別為14.2 min和15.1 min，hIgG和hIgG Fc片段標準曲線方程如表5所示，在0.07～4.5 mg/mL質量濃度范圍內線性良好。根據標準曲線方程計算，95.0 mg bIgG最終得到67.2 mg體外糖基化hIgG，得率為71.7%，40.0 mg體外糖基化hIgG原料經過木瓜蛋白酶水解后可以得到8.3 mg Fc片段，Fc片段得率為20.8%。理論上，Fc片段分子質量約為IgG的1/3，則40.0 mg hIgG中的Fc片段質量為13.3 mg，而實驗檢測所得僅為8.3 mg，造成損失的原因可能由于Protein G蛋白柱與hIgG的結合力有限，也可能是部分亞型hIgG與Protein G蛋白柱結合力較弱導致[36-37]。盡管制備過程伴隨著部分損失，但通過該方法能夠獲得比天然IgG唾液酸化程度更高的IgG。

3 結 論

本研究采用體外糖基化方法制備唾液酸化hIgG，首先使用優化的神經氨酸酶水解條件將bIgG的Neu5Gc殘基酶解，避免了這種非人源唾液酸形式的潛在危害，然后利用B4GALT1和ST6GAL1這2 種糖基轉移酶將半乳糖和Neu5Ac轉移至bIgG，并經過對木瓜蛋白酶酶解hIgG條件的優化與選擇，制備體外糖基化hIgG的Fc片段。結果表明，制備的hIgG分子增加了8.4個半乳糖殘基和42個Neu5Ac殘基，在10 mg/mL hIgG、m（木瓜蛋白酶）∶m（hIgG）＝0.05、10 mmol/L半胱氨酸溶液、2 mmol/L EDTA溶液、pH 7.0條件下酶解3 h可制得較高純度的hIgG Fc片段，最終hIgG得率為71.7%，Fc片段得率為20.8%。本研究為避免動物源食品的潛在風險開啟了新思路，為研究體外糖基化IgG及其Fc片段的生物活性提供了基礎，有助于動物源食品人源化產品的開發利用和動物源產品的營養價值評價。