北京棒桿菌單體天冬氨酸激酶T379N/A380C/T65I/D173G突變體酶學性質表征及工程菌構建

王亞南，劉曉婷，樊占青，王哲人，高 欣，閔偉紅

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

天冬氨酸族氨基酸被廣泛應用于食品、飼料、化妝品、藥物等[1-2]，目前主要采用低成本、對環境友好的微生物發酵法生產[3-4]。其代謝途徑受天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）、高絲氨酸脫氫酶[5]、高絲氨酸酰基轉移酶[6]和高絲氨酸巰基酶[7]調節，其中AK是影響碳流走向的首個關鍵限速調控點，將ATP的磷酸基團轉移到天冬氨酸（Asp），并生成天冬氨酰-4-磷酸[8]，最終轉化為賴氨酸（Lys）、蘇氨酸（Thr）和甲硫氨酸（Met），因此AK對天冬氨酸家族氨基酸產物的積累具有至關重要的影響。為了優化代謝途徑過量積累天冬氨酸族氨基酸，解除變構抑制和提高酶的催化活性成為研究關注點[9-12]。

在已報道的生物體中，AK的晶體結構主要為同型和異型寡聚體[13]，存在形式主要有單功能AK（AKI、AKII和AKIII）和雙功能AK-HSDH（I和II）[14]。如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的AK是一種高寡聚體，AKI受Lys和Met的抑制，AKII和AKIII只受Lys抑制[15-17]；在大腸桿菌（Escherichia coli）中的AKIII是同源二聚體，受Lys抑制[18]；而在谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）中的AKII受Lys和Thr協同抑制[19]，是由α和β亞基組成的異源四聚體（α2β2），α亞基在N末端包含一個催化結構域，在C末端包含一個調節結構域[20]。以上報道的AK均以多聚體形式存在，然而本實驗室發現北京棒桿菌中AK（C. pekinenseaspartate kinase，CpAK）呈單體狀態[21]，與谷氨酸棒桿菌中AK（C. glutamicumaspartate kinase，CgAK）具有98.78%的同源性，可基于CgAK的序列構建CpAK的模型。

與CgAK相同，CpAK含有調節結構域和催化結構域，包含Thr、Lys、ATP、底物Asp 4個關鍵配體。目前，多數研究對調節結構域的抑制劑Lys結合位點進行定點突變[22-25]，對催化結構域ATP、底物Asp結合位點的改造較少。……