北京棒桿菌單體天冬氨酸激酶T379N/A380C/T65I/D173G突變體酶學(xué)性質(zhì)表征及工程菌構(gòu)建

王亞南，劉曉婷，樊占青，王哲人，高 欣，閔偉紅

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

天冬氨酸族氨基酸被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、化妝品、藥物等[1-2]，目前主要采用低成本、對環(huán)境友好的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)[3-4]。其代謝途徑受天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）、高絲氨酸脫氫酶[5]、高絲氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶[6]和高絲氨酸巰基酶[7]調(diào)節(jié)，其中AK是影響碳流走向的首個關(guān)鍵限速調(diào)控點，將ATP的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到天冬氨酸（Asp），并生成天冬氨酰-4-磷酸[8]，最終轉(zhuǎn)化為賴氨酸（Lys）、蘇氨酸（Thr）和甲硫氨酸（Met），因此AK對天冬氨酸家族氨基酸產(chǎn)物的積累具有至關(guān)重要的影響。為了優(yōu)化代謝途徑過量積累天冬氨酸族氨基酸，解除變構(gòu)抑制和提高酶的催化活性成為研究關(guān)注點[9-12]。

在已報道的生物體中，AK的晶體結(jié)構(gòu)主要為同型和異型寡聚體[13]，存在形式主要有單功能AK（AKI、AKII和AKIII）和雙功能AK-HSDH（I和II）[14]。如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的AK是一種高寡聚體，AKI受Lys和Met的抑制，AKII和AKIII只受Lys抑制[15-17]；在大腸桿菌（Escherichia coli）中的AKIII是同源二聚體，受Lys抑制[18]；而在谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）中的AKII受Lys和Thr協(xié)同抑制[19]，是由α和β亞基組成的異源四聚體（α2β2），α亞基在N末端包含一個催化結(jié)構(gòu)域，在C末端包含一個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域[20]。以上報道的AK均以多聚體形式存在，然而本實驗室發(fā)現(xiàn)北京棒桿菌中AK（C. pekinenseaspartate kinase，CpAK）呈單體狀態(tài)[21]，與谷氨酸棒桿菌中AK（C. glutamicumaspartate kinase，CgAK）具有98.78%的同源性，可基于CgAK的序列構(gòu)建CpAK的模型。

與CgAK相同，CpAK含有調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域，包含Thr、Lys、ATP、底物Asp 4個關(guān)鍵配體。目前，多數(shù)研究對調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的抑制劑Lys結(jié)合位點進(jìn)行定點突變[22-25]，對催化結(jié)構(gòu)域ATP、底物Asp結(jié)合位點的改造較少。本研究在各個配體周圍對4個關(guān)鍵殘基位點同時進(jìn)行定點突變，篩選出有效解除反饋抑制的酶活力提高突變體T379N/A380C/T65I/D173G，通過無縫克隆技術(shù)構(gòu)建北京棒桿菌工程菌，旨在為構(gòu)建高產(chǎn)天冬氨酸族氨基酸菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒、菌株與試劑

大腸桿菌重組質(zhì)粒（pET-28a-AK）、大腸桿菌感受態(tài)DH5α和BL21（DE3）、北京棒桿菌AS1.299均由實驗室提供；表達(dá)載體pEC-XK99E 湖南豐暉生物科技有限公司。

質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、Taq酶、核酸電泳Marker、DpnI消化酶 TaRaKa（大連）有限公司；丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；非變性鎳柱柱料 美國GE公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、引物合成、測序由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；無縫克隆試劑盒MonCloneTMHi-Fusion Cloning Mix V2莫納（蘇州）生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母浸粉，1% NaCl；LB固體培養(yǎng)基另加2%瓊脂。

北京棒桿菌感受態(tài)培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基上另加0.3%甘氨酸，0.1%吐溫80。

北京棒桿菌電轉(zhuǎn)化恢復(fù)培養(yǎng)基：0.25%酵母浸提物，0.5%蛋白胨，0.5% NaCl，9.1%D-山梨醇，18.5%腦心浸液，固體培養(yǎng)基另加入2%瓊脂。

種子培養(yǎng)基：2.5%葡萄糖，2%玉米漿，0.1% KH2PO4，0.5% MgSO4，0.125%尿素。

發(fā)酵培養(yǎng)基：10%葡萄糖，2%玉米漿，2% (NH4)2SO4，0.1% KH2PO4，0.05% MgSO4，0.001% MnSO4，0.001% FeSO4，0.000 1% VB1，0.000 6% VB6，0.02% VB12，0.000 01%生物素。

以上培養(yǎng)基均用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 德國Eppendorf AG公司；DYCP-31DN核酸電泳儀 北京市六一儀器廠；Spectra Max 190酶標(biāo)儀美國Molecular Devices公司；超聲破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司；Z36HK低溫高速離心機(jī) 德國Hermle公司；蛋白印記轉(zhuǎn)膜儀 美國Bio-Rad公司；SE260蛋白電泳儀、瓊脂糖凝膠成像儀 美國GE公司；L-8900高速氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 突變株的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增AK基因：運用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，上游引物為5’-GGTCGTGGTGGTTCTNNNACCACTGCAG TTG-3’，下游引物為5’-CGCAACTGCAGTGGTNNNAG AACCACCACG-3’，NNN表示飽和突變，合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。從重組大腸桿菌中提取pET-28a-AK質(zhì)粒并以其為模板，在引物作用下，經(jīng)94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，54～58 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min（以上3 步循環(huán)18 次）；72 ℃保溫10 min完成突變PCR，并進(jìn)行1%瓊脂糖核酸電泳驗證。將驗證成功的PCR產(chǎn)物用DpnI酶37 ℃金屬浴消化2 h。轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主：將2 μL消化后的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入冰上預(yù)冷30 min的BL21感受態(tài)細(xì)胞，冰浴5 min，42 ℃熱激90 s，再冰上孵育2 min，加入不含卡那霉素的LB培養(yǎng)基900 μL，于37 ℃、170 r/min培養(yǎng)1.5 h，9 000 r/min離心2 min棄上清液800 μL，吹懸菌體后涂布于LB固體平板（含終質(zhì)量濃度為50 mg/L卡那霉素）上，37 ℃過夜培養(yǎng)。

高通量篩選：將單克隆菌株從抗性平板轉(zhuǎn)接到96 孔板中過夜培養(yǎng)，加入終濃度為1 mmol/L IPTG，在28 ℃、130 r/min培養(yǎng)12 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。3 500 r/min離心45 min后棄上清液，加入100 μL磷酸鹽緩沖液反復(fù)吹打菌體，凍融破碎后測定其酶活性，高通量篩選出高酶活力的突變株，方法參考文獻(xiàn)[26]。以高酶活力菌株擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液為模板，在克隆引物作用下進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30 次；72 ℃延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行菌液PCR產(chǎn)物驗證，并進(jìn)行基因測序以證明突變株構(gòu)建成功。

1.3.2 蛋白表達(dá)與純化

以2%接種量將野生型（wild type，WT）和突變體菌株在100 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)OD600nm達(dá)到0.7時，添加IPTG（終濃度1 mmol/L）100 μL，分別在25 ℃和28 ℃培養(yǎng)10 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液并加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液重懸菌體，菌體經(jīng)超聲破碎并離心后，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜處理后即為AK粗酶液，將其通過鎳柱分離純化，經(jīng)不同濃度咪唑溶液梯度洗脫去除雜蛋白后得到AK純化液。所得樣液變性后用SDS-PAGE和Western Blot驗證，具體方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.3.3 酶動力學(xué)測定

用10 個不同濃度（0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16 mmol/L）的L-Asp底物進(jìn)行酶活力測定，并在520 nm波長處測吸光度，反應(yīng)體系及條件參考文獻(xiàn)[24]，計算比活力。通過Origin 8.5軟件與Hill方程V=VmaxSn/（Kn+Sn）進(jìn)行非線性擬合。反應(yīng)速率V表示1 min內(nèi)1 mg酶的催化能力，Vmax表示酶完全被底物飽和時的最大反應(yīng)速率。

1.3.4 AK酶學(xué)性質(zhì)分析

最適溫度：底物濃度為3 mmol/L，反應(yīng)體系與酶活力測定相同，在不同溫度（15、20、25、26、28、30、35、40、45、50 ℃）條件下反應(yīng)30 min，最高酶活力定義為100%。

最適pH值：反應(yīng)體系同上，加入不同pH值的Tris-HCl緩沖液（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0），最高酶活力定義為100%。

穩(wěn)定性：在得出的最適溫度和最適pH值條件下，其余反應(yīng)體系不變，反應(yīng)30 min后測定酶活力，0 h酶活力定義為100%，之后每隔1 h測定酶活力，共測10 次。

抑制劑對酶活力的影響：向反應(yīng)體系中加入不同的抑制劑（Thr、Lys、Met、Lys+Thr、Lys+Met、Thr+Met或Thr+Lys+Met），每種或多種抑制劑的最終濃度分別為0.2、1、5、10 mmol/L，以檢測抑制劑對AK活力的影響，添加水的對照組相對酶活力定義為100%。

1.3.5 工程菌構(gòu)建

獲得目的基因片段：提取WT和突變株T379N/A380C/T65I/D173G的質(zhì)粒為模板，在克隆引物作用下經(jīng)94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min（以上3 步循環(huán)18 次）；72 ℃保溫10 min完成PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行1%瓊脂糖核酸電泳，再進(jìn)行膠回收獲得大量的目的基因。

線性化載體pEC-XK99E：提取質(zhì)粒獲得表達(dá)載體pEC-XK99E，線性化載體的反應(yīng)體系為EcoR I酶2 μL、BamH I酶2 μL、pEC-XK99E質(zhì)粒25 μL，將線性化載體進(jìn)行1%瓊脂糖核酸電泳和膠回收。

無縫克隆連接：將膠回收的目的基因片段和線性化載體按以下體系進(jìn)行無縫克隆連接：線性化載體1 μL、目的基因片段2 μL、Hi-Fusion Cloning Mix V2 2.5 μL，連接成功后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，操作方法同于轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)。

電轉(zhuǎn)化入北京棒桿菌：將提取測序成功菌株的質(zhì)粒5 μL加入北京棒桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在冰上預(yù)冷10 min后全部轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯，用20 kV電擊5 ms，加入LBHIS培養(yǎng)基洗滌后，30 ℃、100 r/min復(fù)蘇2 h，若菌濃度過低可延長復(fù)蘇時間。將復(fù)蘇的菌體于8 000 r/min離心2 min后棄去800 μL培養(yǎng)基上清液，剩余200 μL重懸后涂布于北京棒桿菌電轉(zhuǎn)化恢復(fù)固體培養(yǎng)基上（含卡那霉素），30 ℃倒置培養(yǎng)36 h，挑菌測序。

1.3.6 發(fā)酵及氨基酸含量測定

對WT和構(gòu)建的T379N/A380C/T65I/D173G菌株進(jìn)行48 h菌株發(fā)酵培養(yǎng)，每6 h取樣，取氨基酸含量較穩(wěn)定的第30小時發(fā)酵液進(jìn)行氨基酸含量測定[27-29]。取2 g樣品于20 mL水解管中，加入16 mL 6 mol/L鹽酸溶液，真空脫氣30 min，充氮封管，110 ℃水解22～24 h，取出冷卻開管，用去離子水無損轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶并定容。準(zhǔn)確取1 mL水解液于小瓶中，于真空中脫酸抽干，加1 mL水再抽干，再加1 mL水再抽干備用。上機(jī)前準(zhǔn)確加入1 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液，充分溶解，用0.22 μm的水相膜濾膜過濾后用高速氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵突變位點的確定

本實驗室利用SWISS-MODEL構(gòu)建單體AK的三維結(jié)構(gòu)，使用ATP Bind server和COACH-D預(yù)測配體的結(jié)合位點，采用Auto Dock對配體進(jìn)行對接，成功構(gòu)建的單體AK模型見圖1A[21]。利用Clustal X軟件對多個不同生物體內(nèi)的AK進(jìn)行同源序列比對，用ESPript進(jìn)行修飾比對結(jié)果，紅色部分表示高同源性保守位點（圖1B）。運用Discovery Studio 4.0軟件對AK模型進(jìn)行分析，選取了不同配體周圍的4個位點進(jìn)行定點突變：抑制劑Lys的結(jié)合位點Thr379和Aln380，Thr379與抑制劑Lys的羧基由氫鍵緊密連接；Ala380位點與Thr379緊密相連，且與抑制劑Lys通過水分子連接（圖1C）。Thr65通過氫鍵與底物Asp相連是關(guān)鍵的結(jié)合位點（圖1D）。文獻(xiàn)報道，甲烷球菌AK（Methanococcus jannaschiiAK，MjAK）（PDB：2hmf）的Asp211[29]和大腸桿菌（PDB：2j0w）的Asp202位點為催化活性中心位點[18]，利用SPDB軟件對幾種模型進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)比對，發(fā)現(xiàn)都對應(yīng)CpAK中Asp173位點，其位于底物Asp和ATP中間（圖1E）。

圖1 突變位點的確定Fig. 1 Determination of mutation sites

2.2 突變體構(gòu)建

定點突變PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖核酸電泳進(jìn)行驗證，結(jié)果如圖2A所示，在7 000 bp左右有單一明亮條帶，證明目的基因擴(kuò)增成功。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶消化作用后用熱激法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)BL21細(xì)胞中，采用高通量篩選方法篩選出高酶活力突變體，并進(jìn)行菌液PCR，驗證結(jié)果如圖2B所示，在1 000～2 000 bp之間有明顯條帶，與CpAK（1 317 bp）長度一致，證明目的基因AK已成功導(dǎo)入大腸桿菌菌株。對該菌株進(jìn)行測序，測序結(jié)果與AK原序列比對見圖2C，Thr379、Ala380、Thr65、Asp173位點分別由Thr突變?yōu)樘於０罚ˋsn）、由Ala突變?yōu)榘腚装彼幔–ys）、由Thr突變?yōu)楫惲涟彼幔↖le）、由Asp突變?yōu)楦拾彼幔℅ly），成功構(gòu)建了T379N/A380C/T65I/D173G突變體。

圖2 突變體T379N/A380C/T65I/D173G的構(gòu)建Fig. 2 Construction of mutant T379N/A380C/T65I/D173G

2.3 蛋白表達(dá)與純化

將誘導(dǎo)表達(dá)的WT和突變體菌株經(jīng)破碎、離心、過膜后進(jìn)行非變性鎳柱純化，得到AK粗酶液和AK純化液，分別變性后經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot驗證，結(jié)果見圖3，AK純化液在48 kDa左右處均有單一條帶，表明AK蛋白成功表達(dá)。

圖3 SDS-PAGE（A）及Western Blot（B）結(jié)果Fig. 3 Results of SDS-PAGE (A) and Western Blot (B)

2.4 反應(yīng)動力學(xué)分析

圖4 WT和T379N/A380C/T65I/D173G的動力學(xué)分析Fig. 4 Kinetic analysis of WT and T379N/A380C/T65I/D173G

表1 WT及T379N/A380C/T65I/D173G動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of WT and T379N/A380C/T65I/D173G

通過軟件Origin 8.5中的Hill方程V=VmaxSn/（Kn+Sn）進(jìn)行非線性擬合得到Vmax、n和Km，WT和T379N/A380C/T65I/D173G的動力學(xué)參數(shù)分析如圖4和表1所示。T379N/A380C/T65I/D173G的Vmax為267.67 U/（mg·min），WT的Vmax為3.53 U/（mg·min），提高到75.83 倍。Km值表示當(dāng)反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度，突變后AK的Km值由4.11 mmol/L降低至1.34 mmol/L，表明突變后與底物親和力增強(qiáng)。n值為Hill方程的希爾系數(shù)，代表協(xié)同性，其中n＜1表示負(fù)協(xié)同反應(yīng)；n=1表示非協(xié)同反應(yīng)：n＞1表示正協(xié)同反應(yīng)，酶對配體的親和力增大。AK的n值為1.71，突變體T379N/A380C/T65I/D173G的n值為1.07，n值降低，表明突變后AK的正協(xié)同性降低。

2.5 酶學(xué)性質(zhì)表征

2.5.1 溫度對AK活力的影響

如圖5A所示，WT AK最適溫度為25 ℃，突變后T379N/A380C/T65I/D173G AK的最適溫度為30 ℃，最適溫度提高5 ℃。在20～45 ℃溫度范圍內(nèi)，突變體相對酶活力仍保持在60%以上，而且當(dāng)溫度低于20 ℃或高于26 ℃時，突變后的酶活力均高于WT，表明突變改善了酶的耐受溫度性能，這對后期氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)有益。

圖5 WT和T379N/A380C/T65I/D173G的酶學(xué)性質(zhì)表征Fig. 5 Enzymatic properties of WT and T379N/A380C/T65I/D173G

2.5.2 pH值對AK活力的影響

由圖5B可知，WT和T379N/A380C/T65I/D173G的AK最適pH值均為8.0，然而，突變體T379N/A380C/T65I/D173G AK在pH 6～10條件下的相對酶活力均高于WT。

2.5.3 AK穩(wěn)定性分析

分別在WT和T379N/A380C/T65I/D173G AK的最適溫度和最適pH值條件下，測定酶穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5C所示。計算得到WT AK的半衰期為4.24 h，而T379N/A380C/T65I/D173G AK的半衰期為3.56 h，較WT AK縮短了0.68 h，突變導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性減弱。在前2 h和6 h后，突變體T379N/A380C/T65I/D173G AK相對酶活力高于WT，10 h時突變體酶活力仍維持在20%左右，顯著高于此時的WT。

2.5.4 底物抑制劑對AK活力的影響

根據(jù)表2可知，WT AK受Lys、Thr和Met抑制，抑制作用與抑制劑濃度呈正相關(guān)。單個抑制劑Lys濃度為10 mmol/L條件下，抑制率最高為56.22%；由于Lys和Thr兩種抑制劑的共同作用，抑制效果最顯著達(dá)到69.68%，WT AK的相對酶活力為30.32%。CpAK的抑制機(jī)制與CgAK相似，都是通過Thr和Lys的協(xié)同反饋抑制。當(dāng)3種抑制劑共同作用時，最大抑制率為54.56%。突變體T379N/A380C/T65I/D173G AK在大多數(shù)抑制劑濃度下都有抑制作用減弱甚至被明顯激活的趨勢：在不同濃度Lys、Lys+Thr存在時都起到激活作用，尤其是在5、10 mmol/L的底物抑制劑Lys+Thr+Met條件下，相對酶活力分別達(dá)到114.30%和119.42%，說明突變體有效地解除反饋抑制，并且激活作用以劑量依賴性的方式增強(qiáng)。

表2 底物抑制劑濃度對WT和T379N/A380C/T65I/D173G相對酶活力的影響Table 2 Effects of different concentrations of substrate inhibitors on the relative activity of WT and T379N/A380C/T65I/D173G%

2.6 工程菌構(gòu)建及發(fā)酵測氨基酸含量

提取WT和構(gòu)建成功的突變體T379N/A380C/T65I/D173G的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖核酸電泳驗證，結(jié)果如圖6A所示，1 000～2 000 bp之間有明顯條帶，與目的基因（1 317 bp）長度一致。線性化載體pEC-XK99E的大小為7 018 bp，與圖6B條帶位置一致。將膠回收的目的基因片段和線性化載體無縫克隆連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)，然后電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入北京棒桿菌中，質(zhì)粒的核酸電泳驗證結(jié)果如圖6C所示，并測序證明WT和突變體T379N/A380C/T65I/D173G北京棒桿菌構(gòu)建成功。

圖6 工程菌構(gòu)建的核酸電泳驗證Fig. 6 Nucleic acid electrophoresis verification of constructed engineering strains

取30 h的發(fā)酵液進(jìn)行氨基酸含量測定，結(jié)果如表3所示。相較于WT，下游氨基酸產(chǎn)量提高：Lys積累量由0.59 g/L提升至1.08 g/L，提高了83.05%；Thr產(chǎn)量由1.09 g/L增加至1.41 g/L，增加了29.36%；Met產(chǎn)量由0.13 g/L提高到0.17 g/L，提高了30.77%，Asp產(chǎn)量由0.33 g/L下降至0.15 g/L，下降了54.54%。原因可能是AK的Lys結(jié)合位點、ATP結(jié)合位點及底物結(jié)合位點通過突變，有效地解除了Thr和Lys和協(xié)同反饋抑制，提高了酶活性，使碳流量更多地進(jìn)入天冬氨酸族氨基酸的合成途徑，產(chǎn)量得以提高，然而突變后促進(jìn)Asp流向三羧酸循環(huán)，從而使Asp積累量降低。

表3 發(fā)酵液中氨基酸產(chǎn)量Table 3 Amino acid contents in fermentation broth g/L

3 結(jié) 論

對關(guān)鍵位點Thr379、Aln380、Thr65、Asp173同時進(jìn)行定點突變，成功篩選出獲得酶活力顯著提高到75.83 倍的AK突變體T379N/A380C/T65I/D173G，其與底物Asp的親和力增強(qiáng)。酶學(xué)性質(zhì)有利于菌株氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)：最適反應(yīng)溫度由25 ℃提升至30 ℃，耐熱性增強(qiáng)；最適pH值不變，酸堿耐受能力增強(qiáng)；半衰期由4.24 h縮短至3.23 h，穩(wěn)定性略微減弱；有效地解除抑制劑的反饋抑制作用。此外，成功構(gòu)建了北京棒桿菌工程菌，Lys產(chǎn)量達(dá)到1.08 g/L，Thr產(chǎn)量達(dá)到1.41 g/L，Met產(chǎn)量達(dá)到0.17 g/L，為優(yōu)化Asp代謝途徑和構(gòu)建高產(chǎn)天冬氨酸族氨基酸提供參考。