急性心肌梗死患者外周血單個核細胞miR-132、單核細胞趨化蛋白-1的表達及與預后的關系*

李晶瑾， 翟陽， 靳剛， 陳茜， 黃欣**

(1.西安交通大學第一附屬醫院 心血管內科， 陜西 西安 710061； 2.陜西省腫瘤醫院 腫瘤內科， 陜西 西安 710061； 3.西安市華山中心醫院 影像科， 陜西 西安 710061； 4.西安交通大學第一附屬醫院 生殖醫學科， 陜西 西安 710061)

動脈粥樣硬化是一種由內皮損傷和內皮下脂蛋白潴留引起的動脈壁慢性炎癥性疾病，包括單核/巨噬細胞在內的多種細胞及炎癥細胞因子參與了動脈粥樣硬化的發生[1]。最近新發現的小分子物質——微小RNA (microRNA，miRNA) 作為細胞黏附、增殖、脂質吸收和流出以及炎癥介質生成等病理生理過程的重要調節因子，為動脈粥樣硬化發生、發展機制的研究提供了新的分子視角，并提供了新的治療靶點；微小RNA還能夠作為疾病診斷、評估預后和治療反應的特異性生物標志物[2]。miR-132是一種炎癥相關微小RNA，在炎癥性疾病類風濕性關節炎患者的血漿中表達水平升高[3]，在外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中表達也明顯升高[4]，在前體脂肪干細胞中miR-132通過影響核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)的活性來促進促炎細胞因子單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)的表達[5]。生物信息分析(http://www.targetscan.org)顯示miR-132可以和細胞沉默調節蛋白1(sirtuin 1, SIRT1) 3′UTR特異性結合，同時有研究也進一步證實miR-132靶向SIRT1 3′UTR并降低其活性[6]。目前研究證實，SIRT1對內皮功能障礙和氧化應激起保護作用，低水平SIRT1與心肌梗死的病史顯著相關，并且能夠預測冠心病心肌梗死的發生[7]。但是，冠心病急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)患者PBMC中miR-132的表達是否發生改變，miR-132是否參與動脈粥樣硬化及AMI的發生，是否能夠成為診斷AMI及評價預后的指標目前尚不明確。因此，本研究旨在探討AMI患者PBMC中miR-132、MCP-1的表達，與心肌損傷、心衰、左心室重構及AMI預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2018年10月—2019年2月于西安交通大學第一附屬醫院住院患者共174例，其中男124例、女50例。患者臨床癥狀、心電圖、心肌損傷標志物及冠脈影像學檢查等均符合《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南(2019)》[8]及《2020年歐洲心臟病學會非ST段抬高型急性冠狀動脈綜合征管理指南》[9]診斷標準為AMI組，共84例；經冠狀動脈造影或冠狀動脈CTA排除冠心病患者為非冠心病(non-coronary heart disease, NCHD)組，共90例。排除標準：(1)近1月出現過明確感染者;(2)重度腎功能不全(基于MDRD方程計算得出的腎小球濾過率估計值<30 mL/(min·1.73 m2)或長期接受透析);(3)重度肝功能不全(ALT≥正常高限5倍);(4)近1月有外科手術史、活動性出血史者;(5)合并有結締組織疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤者。AMI組患者隨訪1年，收集主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events, MACE)，包括心源性死亡、非致死性AMI、靶血管血運重建以及再住院(復發心絞痛和心力衰竭)，按照是否發生MACE分亞組，1年內發生MACE為預后不良組，無MACE為預后良好組。所有研究對象均對相關研究知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1一般資料、臨床生化及左心室重構及左心功能指標 收集2組患者一般資料(性別、年齡、高血壓及糖尿病史、吸煙史)和臨床生化指標[白細胞計數(WBC)、淋巴細胞計數(LYM)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)、高敏肌鈣蛋白T(hs-cTnT)、N-末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)]及1年隨訪時左心室重構及左心功能指標[左室收縮末期內徑(LVESD)、左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)及心輸出量(CO)]

1.2.2標本采集并提取PBMC 所有患者入院后采集空腹靜脈血5 mL，2 000 r/min離心10 min分離血細胞和血漿，血細胞轉入離心管加PBS至10 mL混勻。15 mL離心管加人外周血淋巴細胞分離液5 mL，將血細胞懸液鋪于人外周血淋巴細胞分離液面上，室溫下2 000 r/min離心20 min(升降速度均調為0)，吸取中間云霧狀的淋巴細胞層即為PBMC，用PBS清洗后無酶EP管-80 ℃凍存。

1.2.3逆轉錄-實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR) PBMC冰上解凍，采用RNAfast200試劑盒提取總RNA。用Nano Drop 檢測總RNA的濃度以及純度，選取1.8≤A260/A280≤2.1的樣本，用逆轉錄試劑盒將RNA及時逆轉錄為cDNA，-20 ℃凍存。miR-132上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTAACAGTCTACAGCCA-3′，miR-132下游引物為5′-CTCAACTGG TGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGACCATG-3′；MCP-1上游引物為5′-AATCAA TGCCCCAGTCACCT-3′，MCP-1下游引物為5′-TCAGCACAGATCTCCTTGGC-3′。分別以 U6、GAPDH為內參照，每組數據取3個樣本行RT-qPCR，反應條件：95 ℃ 10 s預變性，95 ℃ 5 s變性、60 ℃ 15 s退火、72 ℃ 10 s延伸，重復45循環，Real-time PCR Bio-Rad iQ5采集擴增產物的熒光信號并自動分析，獲得擴增曲線、溶解曲線，并根據檢測結果得出Ct值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般資料和臨床生化指標

研究共納入174例患者，其中 AMI組 84例，NCHD組90例。2組患者在年齡、性別、合并高血壓、糖尿病及吸煙史方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)。入院時2組患者臨床生化指標比較，AMI組患者的WBC、LYM、CK、CKMB、hs-cTnT、NT-proBNP、TG、CHOL、LDL-C均較NCHD組升高、HDL-C較NCHD組降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 AMI組和NCHD組患者一般資料和臨床生化指標Tab.1 Clinical characteristics of NCHD and AMI groups

2.2 左心室重構及左心功能指標

1年隨訪時， AMI組LVESD、LVEDD較NCHD組升高，LVEF、LVFS、CO較NCHD組降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 AMI組和NCHD組患者1年隨訪時的左心室重構及左心功能指標Tab.2 Cardiac ultrasound indexes of

2.3 PBMC中miR-132和MCP-1的表達

AMI組患者PBMC中miR-132、MCP-1的相對表達水平明顯高于NCHD組(t=10.37、10.59，P<0.01)。見圖1。

注：A、B分別為miR-132和MCP-1表達的定量結果；(1)與NCHD組比較，P<0.01。圖1 AMI組和NCHD組患者PBMC中miR-132和MCP-1的表達Fig.1 Expression levels of miR-132 and MCP-1 in PBMCs of AMI and NCHD groups

2.4 PBMC中miR-132和MCP-1的相關性分析

AMI患者PBMC中MCP-1與miR-132表達呈正相關，差異有統計學意義(r=0.71，P<0.01)；對所有患者MCP-1與miR-132表達量進行相關性分析，結果顯示二者呈正相關且差異有統計學意義(r=0.82，P<0.01)。見圖2。

注：A為AMI患者，B為所有患者。圖2 不同患者MCP-1與miR-132表達的相關性Fig.2 Correlation analysis of miR-132 and MCP-1

2.5 AMI患者miR-132、MCP-1與心肌損傷標志物、NT-proBNP及心臟超聲指標的相關性

AMI患者PBMC中miR-132、MCP-1表達量，與血清CK、CKMB、hs-cTnT、NT-proBNP正相關且差異具有統計學意義(P<0.01)；與心臟超聲指標LVESD、LVEDD正相關且且差異具有統計學意義(P<0.01)；與心臟超聲指標LVEF、LVFS、CO負相關且差異具有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 miR-132、MCP-1與心肌損傷標志物、NT-proBNP及心臟超聲指標的相關性Tab.3 Correlation analysis of miR-132, MCP-1 with myocardial injury markers, NT proBNP, and cardiac ultrasound indexes

2.6 miR-132和MCP-1對AMI的診斷價值

ROC曲線顯示，PBMC中miR-132表達量診斷AMI的AUC為0.92(95%CI為0.88～0.96，P<0.01),診斷靈敏度為84.52%、特異度為82.22%；MCP-1表達量診斷AMI的AUC為0.90(95%CI為0.86～0.95，P<0.01),診斷靈敏度為96.43%、特異度為80.00%。二者聯合診斷AMI的AUC為0.96(95%CI為0.94～0.98，P<0.01),診斷靈敏度為89.29%、特異度為85.56%。見圖3。

圖3 miR-132和MCP-1對AMI的ROC曲線Fig.3 ROC curves of miR-132 and MCP-1 for AMI

2.7 不同預后AMI患者miR-132、MCP-1與心肌損傷標志物、NT-proBNP及心臟超聲指標

AMI患者依據隨訪1年是否發生MACE時間分為預后不良組(n=24)及預后良好組(n=60)。對2個亞組miR-132、MCP-1、心肌損傷標志物，以及反映左室重構和左心功能的超聲指標進行分析發現：與預后良好組相比，預后不良組PBMC中miR-132、MCP-1表達量升高且差異有統計學意義(P<0.01)；血清中hs-cTnT、NT-proBNP升高且差異有統計學意義(P<0.01)；心臟超聲指標LVESD、LVEDD升高，LVEF、LVFS、CO降低，且差異有統計學(P<0.01)。見表4。

表4 不同預后AMI患者miR-132、MCP-1與心肌損傷標志物、NT-proBNP及心臟超聲指標Tab.4 miR-132, MCP-1，myocardial injury markers, NT proBNP, and cardiac ultrasound indicators in the patients with different

2.8 是否發生MACE的多因素回歸分析

對AMI患者隨訪1年發生MACE的預后不良組及無MACE的預后良好組，兩組間有差異的指標進行多因素回歸分析，結果顯示miR-132、MCP-1、NT-proBNP，以及心臟超聲指標LVESD、LVEDD、LVEF、LVFS是AMI是否發生MACE的獨立危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 MACE相關危險因素的多因素回歸分析Tab.5 Multivariate regression analysis of MACE related risk factors

2.9 miR-132和MCP-1對AMI患者預后不良的評估價值

AMI組1年隨訪發生MACE提示預后不良。ROC曲線顯示，PBMC中miR-132表達量預測AMI患者預后不良的曲線下面積為0.84(95%CI為0.76～0.93，P<0.01)，診斷靈敏度為87.50%，特異度為75.00%； MCP-1表達量預測AMI患者預后不良的AUC為0.74(95%CI為0.62～0.87，P<0.01),診斷靈敏度為79.17%、特異度為68.33%。二者聯合預測 AMI患者預后不良的AUC為0.85(95%CI為0.76～0.93，P<0.01),診斷靈敏度為79.17%，特異度為73.33%。見圖4。

圖4 miR-132和MCP-1對AMI預后不良的ROC曲線Fig.4 ROC curves of mir-132 and MCP-1 for poor prognosis of AMI

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是一種慢性炎癥性疾病[10]。動脈粥樣硬化的發生同代謝紊亂和炎癥直接相關，微小RNA作為一種調節基因表達的小分子，能夠結合到靶信使RNA的3′非翻譯區或特異性抑制翻譯，從而誘導生理過程或信號通路的調節，參與調節炎癥反應、血管生成發育和脂質代謝，直接影響動脈粥樣硬化的發生發展[11-13]。如：miR-145通過靶向CD137和活化T細胞的核因子1抑制NLRP3炎癥小體活化[14]；miR-19b可能通過下調ABCA1表達導致膽固醇紊亂[15]；miR-132作為新的血管平滑肌細胞增殖調節因子，通過抑制TRAF作用蛋白的表達抑制新生內膜的形成[16]。微小RNA在轉錄后水平調控基因，參與病理生理過程，在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發生和發展過程中發揮至關重要的作用[17]。

miR-132是一種炎癥相關性微小RNA。脂多糖能夠刺激單核細胞并誘導其高表達miR-132[18]。角質形成細胞中miR-132可以抑制NF-κB途徑減少趨化因子的產生和吸引白細胞的能力，相反miR-132增加了STAT3和ERK通路的活性[19]。SIRT1減輕動脈粥樣硬化大鼠血管內皮炎癥改善內皮功能[20]，研究發現miR-132靶向SIRT1 3′UTR并降低其活性，從而導致凋亡誘導劑p53乙酰化的增加[6]。原代人脂肪干細胞miR-132過度表達足以誘導NF-κB易位、p65乙酰化，從而激活NF-κB和IL-8和MCP-1的轉錄，最終導致IL-8、MCP-1表達增加[5]。系統性紅斑狼瘡和類風濕關節炎患者血清中miR-132、miR-143、miR-155、MiR-29a、表達水平明顯升高[21]，在類風濕性關節炎患者PBMC中觀察到miR-132的表達明顯升高[22]。miR-132靶向SIRT1 3′UTR可以促進動脈硬化的進展，同時也可作為炎癥性疾病診斷新的生物標志物。

PBMC主要含有單核細胞及淋巴細胞，能夠參與炎癥過程，在炎癥性疾病的調控中起到重要的作用，對動脈粥樣硬化性心臟病的發生發展有直接的影響[23]。PBMC、巨噬細胞在免疫激發后能夠合成大量NO，以對某些炎性細胞因子(包括IFN-γ、IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-15)做出反應，PBMC相關的生物標志物為心血管疾病的發病機制和診斷提供了新的思路[24]。MCP-1作為單核細胞趨化因子的一員，在單核細胞募集、遷移，進而轉化為巨噬細胞過程中發揮重要作用，直接參與動脈粥樣硬化的進展，并且可能影響到動脈粥硬化斑塊的穩定性[25]，在AMI發生中具有重要意義。

本研究比較了AMI及NCHD患者PBMC中miR-132及MCP-1表達的差異，發現miR-132及MCP-1的表達量在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病AMI患者PBMC中升高，提示二者與AMI的發生發展有關，miR-132與MCP-1表達量正相關，結合既往研究推測，二者有可能均通過SIRT1/NF-κB信號通路影響AMI的發生，有待細胞實驗進一步證實。AMI的發生伴隨著心肌壞死，引發心室重構及心功能下降。本研究分析了反映心肌壞死的心肌損傷標志物CK、CKMB、hs-cTnT，反應心功能的NT-proBNP、LVEF、LVFS、CO，以及反應心室重構的LVESD、LVEDD指標，發現AMI組患者CK、CKMB、hs-cTnT、NT-proBNP、LVESD、LVEDD水平均高于NCHD對照組，LVEF、LVFS、CO均低于對照組，提示了AMI患者存在心室的重構及心功能下降。對AMI患者隨訪收集MACE事件，進而按預后進行亞組分析顯示，AMI預后不良亞組miR-132、MCP-1、hs-cTnT、NT-proBNP、LVESD、LVEDD明顯高于預后良好亞組，LVEF、LVFS、CO明顯低于預后良好亞組，提示AMI患者預后不良，與心肌壞死、心功能下降及左心室重構有關。多因素回歸分析顯示miR-132、MCP-1、NT-proBNP、LVESD、LVEDD、LVEF、LVFS為AMI患者1年是否發生MACE的獨立危險因素。進一步研究顯示，AMI患者PBMC中miR-132、MCP-1表達量與心肌損傷標志物CK、CKMB、hs-cTnT相關；與心衰指標NT-proBNP、LVEF、LVFS、CO相關；與左心室重構指標LVESD、LVEDD相關，提示miR-132、MCP-1可能與心肌損傷、心功能、左心室重構相互影響，從而協同AMI的發生、影響AMI的預后，機制尚需深入研究證實。miR-132 、MCP-1診斷AMI的AUC分別為0.92、0.90，聯合AUC為0.96，兩者聯合可有效提高AMI的診斷效能；預測AMI預后不良的AUC分別為0.85、0.74，聯合AUC為0.84，提示miR-132 、MCP-1對診斷AMI以及預測預后不良均有一定的價值，為臨床上AMI的診斷、治療和預后評估提供了新的思路。

本研究提示，miR-132與MCP-1在AMI患者PBMC中表達量升高，與心肌損傷的程度、左室重構及左心功能有關，有可能作為AMI診斷及預后評估的生物學新指標。