子宮內膜癌患者POLQ樣蛋白解旋酶的表達及臨床意義*

覃紅， 張瑜

(1.中南大學湘雅醫院 婦科， 湖南 長沙 410008； 2.湘西自治州人民醫院&吉首大學第一附屬醫院 婦科， 湖南 吉首 416000)

子宮內膜癌(endometrial carcinoma，EC)是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發病率高及死亡率高，嚴重威脅女性的生命健康，因此，早期識別診斷EC可及時進行治療，從而有效地改善疾病的預后[1-2]。目前臨床上主要依據病理形態學早期診斷EC，但效果不佳。因此，尋找新的分子標記物用于早期識別癌前病變和診斷EC具有重要意義[3]。POLQ樣蛋白解旋酶(helicase POLQ-like，HELQ)是一種核蛋白，可催化DNA雙鏈解螺旋，從而參與機體DNA修復過程[4-5]。HELQ在多種惡性腫瘤中常發生缺失或低表達，推測其在腫瘤疾病的發生、發展中可能發揮抑癌基因作用，如肝癌、白血病、卵巢和乳腺癌[6]。目前國內外關于HELQ在EC早期診斷和預后評估中的作用研究鮮有報道，本研究通過比較正常子宮內膜、子宮內膜伴不典型增生及EC中HELQ表達的差異，分析HELQ表達水平與EC臨床特征的相關性及其死亡預后的影響，現將結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年12月—2019年5月收治的年齡≥18周歲、臨床信息和病理資料齊全患者為研究對象，其中EC患者37例(EC組)、子宮內膜不典型增生患者43例(增生組)及正常子宮內膜患者30例(正常組)。EC組患者系擇期行EC全面分期手術、取內膜組織行病理學診斷為EC，增生組患者系行全子宮切除術后或診斷學刮宮手術、取內膜組織行病理學診斷為子宮內膜不典型增生，正常組患者系因子宮內膜息肉、異常子宮出血或子宮肌瘤等行診斷學刮宮術或全子宮切除術、取內膜組織行病理學診斷為正常子宮內膜組織。排除標準：(1)術前曾接受過放、化療等治療；(2)合并其他惡性腫瘤和或其他婦科惡性腫瘤；(3)術前1年接受過雌激素、孕激素等相關藥物治療；(4)病理結果為炎性改變，或者同時合并炎癥細胞浸潤；(5)合并嚴重心臟、肝臟、腎臟等器質性疾病；(6)妊娠或哺乳期婦女；(7)意識障礙或精神異常，無法配合隨訪；(8)閱片時發生脫片、病理診斷不明確。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1子宮內膜標本制作及切片 取3組患者子宮內膜組織，采用10%甲醛固定，常規制作石蠟切片，石蠟切片靜置于蘇木素染料5 min，流水沖洗，置于1%鹽酸乙醇溶液分化3 s，沖洗切片5 min；切片置于1%氨水溶液中反藍15 s，沖洗后蒸餾水中靜置；置于伊紅溶液染色2 min，依次放入75%乙醇溶液5 min、85%乙醇溶液5 min、無水乙醇Ⅰ溶液5 min、無水乙醇Ⅱ溶液5 min及二甲苯溶液5 min；風干切片，中性樹膠封片，顯微鏡(日本尼康公司)下觀察組織切片，由病理醫師核對診斷結果。

1.2.2HELQ的檢測及陽性判斷 采用免疫組織化學法(immunohistochemistry，IHC)檢測3組研究對象子宮內膜組織中HELQ蛋白表達水平，按照試劑盒中說明書操作。福爾馬林浸泡30 min、固定24 h，脫水、石蠟包埋后制成蠟塊、切片厚3.5 μm；40 ℃溫水上切片，65 ℃烤片機烘烤至水干蠟化；切片脫蠟、抗原修復、內源性過氧化物酶阻斷、血清封閉、一抗和二抗孵育(抗體濃度均為1 ∶200)、辣根過氧化物酶(3,3N-Diaminobenzidine tertrahydrochloride，DAB；塞維爾武漢生物科技有限公司生產)顯色、胞核復染及脫水制片后，全自動玻片掃描系統掃描玻片、閱片；根據免疫反應評分[immunoreactive score，IRS；IRS=染色強度(staining intensity，SI)×陽性細胞百分比(percentage of positive cells，PP)]系統進行評價，每張玻片計數5個高倍鏡視野，將強度評分與陽性細胞百分數評分相乘得出IRS，規定IRS評分>2分為HELQ陽性[7]。

1.2.3Envision法檢測腫瘤增殖指數(anti-Ki67，Ki67)檢測 按SP-9000試劑盒說明書操作步驟檢測3組研究對象子宮內膜組織中Ki67表達水平。隨機選擇10個(400×)視野下計數100個細胞，根據著色情況將細胞按以下規則計分，陽性細胞數染色為未被著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色分別計0、1、2 及 3分；計算陽性細胞百分率，<5%記0分、5%≤～<25%記1分、25%≤～<50%記2分、50%≤～<75%記3分、≥75%記4分，最后根據著色和陽性細胞百分率評分結果乘積得分判斷陽性和陰性，規定乘積得分0分為陰性(-)、 乘積得分1分及以上為陽性(+)[8]。

1.2.4雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)檢測及結果判斷 將3組研究對象子宮內膜組織切片常規脫蠟，采用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗；采用3%過氧化氫室溫下浸泡10 min，PBS清洗；浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，92～98 ℃微波爐10 min，室溫冷卻30 min，PBS清洗；加2%羊血清，室溫20 min；去除液體，滴加鼠抗人雌激素、孕激素受體單克隆抗體，4 ℃過夜，PBS清洗；DAB顯色，蘇木精染色、脫水、透明及封片；ER、PR主要定位于細胞核，細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，計算陽性細胞百分率[陽性細胞百分率(%)=陽性細胞數/顯微鏡下計數細胞數] ，≤10%為陰性(-)，>10%為陽性(+)[9]。

1.2.5基礎、臨床及術后隨訪信息 收集3組研究對象的基礎信息，包括年齡、身高、體質量、體質量指數(body mass index, BMI)、孕產史、流產史及婦科疾病史；收集EC組患者子宮內膜癌分化程度、國際婦產科協會(the International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGP)分期、肌層浸潤深度、淋巴結轉移及脈管浸潤情況；采用門診復診或電話隨訪EC患者術后情況，隨訪截止時間為2021年1月1日，隨訪內容包括隨訪時間(單位為月)、患者是否發生死亡和原因、是否失訪和原因等。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 基礎信息

3組研究對象年齡、BMI、孕產史、流產史和婦科疾病史比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 各組研究對象的基礎信息比較Tab.1 Comparison of basic information in each group

2.2 HELQ陽性表達

3組研究對象子宮內膜組織中HELQ陽性表達比較，EC組患者子宮內膜組織中HELQ陽性表達人數少于正常組和增生組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組研究對象子宮內膜組織中HELQ陽性表達Tab.2 Comparison of positive expression of HELQ in endometrial tissues of each group

2.3 EC組患者HELQ表達與臨床病理學特征、免疫組織化學指標的關系

EC組患者中HELQ陰性和陽性者的腫瘤肌層浸潤深度、脈管浸潤、PR表達及Ki67表達比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 EC組患者中HELQ表達與臨床病理學特征、免疫組織化學指標的關系Tab.3 Correlation between clinicopathological/immunohistochemical features and HELQ expression in endometrial cancer group

2.4 HELQ表達與EC患者死亡的相關性

37例EC患者隨訪時間為0～61個月，中位隨訪時間為39.5個月，死亡3例，總死亡率為8.11%；壽命表法分析結果顯示，1、3、5年生存率分別為97.0%、94.0%及89.0%；Cox回歸結果顯示，校正協變量腫瘤的肌層浸潤深度、脈管浸潤、Ki67表達及PR表達后，EC患者HELQ表達對其死亡的發生無影響(P>0.05)；Kaplan-Meier分析結果顯示，HELQ陽性和HELQ陰性EC患者生存率差異無統計學意義(P>0.05)。見表4和圖1。

表4 Cox回歸分析HELQ表達與EC患者死亡的相關性Tab.4 Correlation between HELQ expression and death in patients with endometrial cancer patients by Cox regression analysis

圖1 HELQ表達陽性和陰性EC患者的生存曲線比較Fig.1 Comparison of survival curves of patients with HELQ expression-positive and HELQ expression-negative

2.5 HELQ表達對EC患者死亡的預測作用

ROC分析結果顯示，HELQ、HELQ×Ki67、HELQ×PR、HELQ×Ki67×PR預測EC死亡發生AUC分別為0.642、0.711、0.676、0.725，均大于0.5，但P>0.05。見表5和圖2。差異無統計學意義，提示HELQ表達對EC患者死亡無預測作用。

表5 ROC曲線分析HELQ表達在EC患者死亡發生預測中的效能Tab.5 Efficacy of HELQ expression in predicting the death of endometrial cancer patients by ROC curves

圖2 HELQ及HELQ聯合其他指標預測EC患者死亡發生的ROC曲線Fig.2 HELQ and HELQ combined with other indexes to predict the ROC curve of death in EC patients

3 討論

近年來研究發現，HELQ與生殖健康和腫瘤疾病密切相關[10]，HELQ缺失或低表達可增加DNA損傷風險，提高腫瘤發生率。動物實驗結果也證明[11]，HELQ與卵巢腫瘤、垂體瘤中生殖細胞缺失有關，敲除HELQ基因的小鼠生殖能力下降、生殖細胞缺失、DNA股間交聯敏感以及致癌傾向。本次研究結果顯示，隨著子宮內膜從正常到癌變過程中HELQ陽性表達率逐漸下降(P<0.05)，在EC患者子宮內膜組織中陽性表達率最低，與劉芳平等[12]、李亞萍等[13]、Liu等[14]研究結果一致，提示HELQ在EC中低表達，可作為惡性腫瘤早期診斷的新分子，在EC早期診斷中具有一定的應用價值。

肌層浸潤深度、脈管浸潤及Ki67陽性率在既往研究中已被證實是EC預后評估的重要指標，張品等[15]研究認為，深肌層浸潤是EC預后獨立危險因素，能夠增加EC死亡發生風險。趙昌芹等[16]研究顯示，EC伴有腫瘤脈管浸潤患者術后復發風險相對無脈管浸潤增加3倍。R?dulescu等[17]研究發現，Ki67與腫瘤的增殖有關，其陽性表達可影響EC患者生存率和復發。本研究中，HELQ陽性組和HELQ陰性組肌層浸潤深度、脈管浸潤、Ki67陽性率和PR陽性率存在差異(P<0.05)，相關性分析中HELQ陽性率越低，則患者肌層浸潤深度、脈管浸潤、Ki67陽性率和死亡發生率越高(P<0.05)，提示HELQ可能作為抑癌基因參與EC腫瘤細胞增殖、浸潤及轉移的過程，當HELQ缺失或既表達則可促進腫瘤的發生、發展。有研究顯示，EC中80%屬于激素依賴型(Ⅰ型)，是由于雌激素過度刺激導致子宮內膜增生，從而引發EC[18-20]。而孕激素能夠通過與子宮內膜上PR結合，誘導過度增生的子宮內膜向分泌期轉化，防止EC的發生[21-22]。本次研究結果顯示，HELQ陰性組EC患者肌層浸潤深度>1/2、脈管侵襲比率及Ki67陽性率較HELQ陽性組高(P<0.05)，提示HELQ在EC發生、發展中發揮抑癌基因作用，當HELQ陰性或低表達時，腫瘤細胞的增殖、侵襲及浸潤能力增加，導致腫瘤病情的進展。同時，HELQ陰性組PR陽性率較HELQ陰性組低，孕激素不能有效結合PR拮抗雌激素發揮保護子宮內膜的作用，從而促進了EC的發生、發展。因此，推測HELQ在EC預后中具有重要作用。

有學者關于HELQ在惡性腫瘤預后中作用進行了研究。高峻等[23]研究顯示，HELQ與原發性肝細胞癌的發生密切相關，HELQ蛋白低表達導致原發性肝細胞癌患者預后不良；Guo等[24]研究顯示在慢性淋巴細胞性白血病患者中HELQ表達水平與IGHV變異相關，而慢性淋巴細胞性白血病與靶細胞信號通路相關的預后與HELQ/EGR3的表達相關，慢性淋巴細胞性白血病患者HELQ缺失導致其預后不良；Long等[25]研究表明，HELQ表達與卵巢癌患者對鉑類化療的反應、總生存期及無病生存期有關，在腫瘤細胞過表達和敲除HELQ蛋白，能分別增加和降低細胞DNA修復活性，從而分別增加和降低腫瘤對順鉑耐藥性，能作為預測卵巢癌患者化療耐藥和判斷患者預后的指標。本次研究中，HELQ表達與EC患者死亡預后呈負相關(P<0.05)，但校正混雜因素后，HELQ表達并不是EC死亡預后的獨立影響因素(P>0.05)，提示與既往研究結果不同，一方面與樣本量小、發生死亡結局人數過少、研究結果可靠性有限有關；另一方面提示HELQ可能通過調控其他基因或分子物質表達，從而影響EC的疾病進展和預后。ROC曲線分析結果顯示，HELQ、HELQ聯合其他病理學、免疫組織化學指標預測EC患者死亡AUC>0.5(P>0.05)，提示HELQ雖然與死亡預后發生有一定相關，但在預后評估中作用還有待進一步探討。

本次研究分別檢測正常子宮內膜、子宮內膜不典型增生和EC子宮內膜組織中檢測HELQ表達，初步探討了EC和EC癌前病變中檢測HELQ表達水平的變化趨勢；分析EC中HELQ表達與臨床病理學特征和免疫組化指標的相關性，為后續HELQ參與EC發生、發展的具體作用機制研究提供線索；探討HELQ表達對EC死亡預后的影響及在預后評估中的預測作用，有助于早期識別EC術后不良預后發生的高危人群，及時采取干預措施，防止不良疾病轉歸。但本研究也存在一定不足：首先，樣本例數較小，病例僅來源于一家醫院，研究對象選取可能存在選擇偏倚；其次，未驗證HELQ對細胞生物學功能的影響及其在EC發生、發展中的作用機制；最末，隨訪中僅以死亡為結局，而臨床實際中EC患者術后復發率較死亡率高，未探討HELQ對EC患者復發的影響，預后評價不全面。這些都有待后續擴大樣本量、多中心進一步深入研究探討。

綜上所述，EC患者HELQ陽性表達率較子宮內膜不典型增生患者和正常子宮內膜女性低，可能與EC的發生、發展及死亡有關，早期檢測HELQ表達有助于臨床診療工作開展。