亞砷酸鈉對小鼠肝細胞AML12氧化應激、凋亡及MST1、MST2蛋白表達的影響*

趙哲儀， 王正蓉， 方興艷， 王甜， 羅昭遜， 謝婷婷*

(1.貴州醫科大學附屬醫院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 醫學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學附屬醫院 產前診斷中心， 貴州 貴陽 550004； 4.山東省立第三醫院 檢驗科， 山東 濟南 250031； 5.貴州醫科大學 兒科學院， 貴州 貴陽 550004)

地方性砷中毒是嚴重危害人體健康的生物地球化學性疾病之一，目前已發現的地方性砷中毒病區遍布于全球70多個國家，至少有2億人面臨砷暴露的風險[1]。砷中毒是以多臟器多系統損害為特點的全身性疾病，肝臟亦是砷毒作用的主要靶器官之一[2]。研究發現，砷所致機體內氧化與抗氧化作用失衡、細胞凋亡信號通路異常是砷中毒的重要機制[3-4]。哺乳動物不育系20樣激酶1(mammalian sterile 20-like kinases 1，MST1)和MST2是不育系20樣激酶家族中具有進化保守性的、編碼絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶的同源基因[5]。以往動物及細胞水平的研究表明，MST1和MST2能通過調節多條信號通路促進氧化應激和凋亡，且磷酸化MST1/2(phosphorylated-MST1/2,p-MST1/2)能通過激活Hippo信號通路抑制一系列抗氧化及抗凋亡因子的表達[6-8]。盡管MST1和MST2與砷毒性作用相關的信號通路存在相互作用關系[9-10]，但目前未有報道表明砷對肝細胞p-MST1/2、MST1及MST2表達水平的影響。因此，本研究用亞砷酸鈉(sodium arsenite，NaAsO2)對正常肝細胞AML12進行染毒處理，探究砷對肝細胞氧化應激、凋亡以及MST1/2表達的影響，為砷所致肝損傷疾病的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 小鼠正常肝細胞AML12購自中國科學院細胞庫。

1.1.2主要試劑和儀器 NaAsO2(美國Merck公司)，2.5 g/L胰蛋白酶溶液、DMEM/F-12培養基及磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS；美國Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；美國Corning公司)，青霉素、鏈霉素(美國Hyclone公司)，細胞培養瓶、培養皿(無錫耐思生物科技有限公司)，細胞凍存液、普通RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、蛋白marker和聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒(北京索萊寶生物有限公司)，化學發光試劑(electrochemiluminescence，ECL；美國Millipore公司)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，二辛可寧酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)，兔抗小鼠p-MST1/2單克隆抗體(美國CST公司)，兔抗小鼠MST1、MST2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗(英國Abcam公司)，兔抗小鼠半胱氨酸蛋白酶3剪接體(cleaved caspase 3, c-caspase 3)單克隆抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)。

1.1.3主要儀器 倒置光學顯微鏡(日本OLympus公司)，ELX800 酶標儀(美國Bio-Teck公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，小型垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養、NaAsO2染毒處理及分組 小鼠正常肝細胞AML12用含10%FBS的DMEM /F-12培養基，于5%CO2、37 ℃恒溫條件下培養；待細胞融合率達80%時，進行傳代、凍存及后續實驗。常規培養時，每隔2 d進行換液，傳代比例為1 ∶2；待細胞融合率達80%時，棄原培養基，0、10、15、20、25及30 μmol/L NaAsO2的完全培養基溶液繼續培養24 h，以不含NaAsO2為對照組，其余各濃度NaAsO2處理組為實驗組。

1.2.2熒光探針染色法檢測AML12細胞內ROS含量 取處于對數生長期的AML12細胞接種于6孔板中，實驗組NaAsO2染毒處理后，棄各組細胞的原培養基，加含10 μmol/L活性氧熒光探針(DCFH-DA)的DMEM/F-12培養基1 mL繼續于37 ℃孵育細胞1 h；棄含染料的培養基，PBS洗滌細胞2次，加適量PBS于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞內的熒光強度。

1.2.3化學比色法檢測AML12細胞內SOD活性 取處于對數生長期的AML12細胞接種于6孔板中，實驗組NaAsO2染毒處理后，消化收集各組細胞至離心管，按每500萬細胞加蛋白提取液1 mL，行超聲破碎裂解細胞后，4 ℃下8 000 r/min離心10 min，取部分上清測定蛋白濃度，再按說明書配制SOD活性檢測反應體系行吸光度檢測，計算每克樣本質量中MDA的含量；每組樣本設置3個復孔，并重復3次實驗。

1.2.4Western blot法檢測AML12細胞內p-MST1/2、MST1、MST2及c-caspase 3蛋白相對表達量 取處于對數生長期的AML12細胞接種于6孔板中，實驗組NaAsO2染毒處理后，棄各孔中原培養基，按100 ∶1 ∶1的比例加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑及蛋白磷酸酶抑制劑提取總蛋白；經BCA法測定蛋白濃度，再將蛋白樣品與1/4倍體積的5×SDS-PAGE上樣緩沖液充分混勻，置于100 ℃金屬浴中加熱8 min；各組蛋白均以40 μg上樣量進行SDS-PAGE電泳分離，轉移至PVDF膜上，5%BSA封閉2 h，TBST洗膜3次、10 min/次，分別加p-MST1/2抗體(1 ∶1 000)、MST1抗體(1 ∶10 000)、MST2抗體(1 ∶10 000)及c-caspase 3抗體(1 ∶1 000)和GAPDH抗體(1 ∶10 000)于4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次、10 min/次，加山羊抗兔IgG二抗(1 ∶10 000)于室溫孵育2 h，TBST洗滌3次、10 min/次，ECL顯影；采用Image J軟件統計蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參照計算各目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行數據統計學分析，所有計量資料均進行正態性檢驗、方差齊性檢驗；計量資料呈正態分布且方差齊時，組間比較采用單因素方差分析法，進一步兩兩比較采用最小顯著性差異法(least significance difference t test,LSD-t)；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ROS含量

倒置熒光顯微鏡結果表明，與對照組相比，隨著NaAsO2濃度的增高，10～30 μmol/L NaAsO2各組小鼠AML12細胞內ROS的熒光強度逐漸增強，且差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為熒光探針染色法檢測結果(200×)，B為熒光強度的定量結果；(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與15 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(5)與25 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖1 各組小鼠AML12細胞的ROS表達Fig.1 The contents of ROS in AML12 hepatocytes of mice in each group

2.2 SOD活性

化學比色法檢測結果表明，與對照組相比，10～30 μmol/L NaAsO2各組小鼠AML12細胞內SOD活性降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與15 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(5)與25 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖2 各組小鼠AML12肝細胞的SOD活性Fig.2 The activity of SOD in AML12 hepatocytes of mice in each group

2.3 p-MST1/2、MST1、MST2和c-caspase 3蛋白表達

Western blot結果顯示，與對照組相比，10～30 μmol/L NaAsO2組小鼠AML12細胞內p-MST1/2蛋白相對表達量增加(P<0.05)，20～30 μmol/L NaAsO2組小鼠AML12細胞內MST1蛋白相對表達量降低、c-caspase 3蛋白相對表達量升高(P<0.05)，15～30 μmol/L NaAsO2組小鼠AML12細胞內MST2蛋白相對表達量升高(P<0.05)。見圖3。

注：A為Western blot檢測各蛋白結果；B為各蛋白表達的定量結果；(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與15 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(5)與25 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖3 各組小鼠AML12細胞內p-MST1/2、MST1、MST2及c-caspase 3蛋白的表達(Western blot)Fig.3 The protein expression levels of p-MST1/2, MST1, MST2, and c-caspase 3 in AML12 hepatocytes of mice in each group(Western blot)

3 討論

ROS是一類具有高化學反應活性的含氧物質，其主要來源于線粒體內的氧化呼吸鏈[11]。當機體發生氧化應激時，體內的抗氧化物質不足以清除氧化物質，使得ROS過度積累，最終導致組織細胞損傷[12]。SOD作為生物體內的一線抗氧化酶，在清除ROS、維持氧化與抗氧化平衡中具有重要作用，其水平高低可直接反應體內氧化應激狀態[13]。而ROS作為連接氧化應激和凋亡的樞紐，可通過多種途徑激活凋亡信號通路，進而促進caspase-3發生裂解而活化，最終導致細胞凋亡[14]。本研究通過體外構建砷暴露細胞模型發現：隨著染砷劑量的增加，AML12細胞內ROS含量逐漸增加，SOD活性逐漸下降，c-caspase 3蛋白相對表達量逐漸增加，提示砷可以明顯誘導AML12細胞發生氧化應激和凋亡。

MST1和MST2作為不育系20樣激酶家族中受到廣泛研究的成員，在細胞氧化應激、凋亡、增殖、分化等多種生物學過程中都發揮著重要作用[15-16]。研究表明，MST1/2屬于Hippo信號通路中關鍵的信號傳導激酶，可在氧化應激狀態下發生自磷酸化而被激活，活化的MST1/2可通過激酶級聯反應抑制一系列抗凋亡因子的表達[17-19]。此外，基因敲除實驗表明，敲低MST1/2能降低p53的表達量及caspase-3的活性，從而抑制細胞凋亡[20-21]。本實驗結果顯示，在NaAsO2誘導AML12細胞發生氧化應激和凋亡過程中，p-MST1/2和MST2蛋白的相對表達量增加，MST1蛋白相對表達量逐漸降低，推測MST1/2可能通過其磷酸化形式以及提高caspase-3活性參與了砷致肝損傷過程，但其具體生物學機制有待深入研究。與本實驗結果類似的，Shi等[22]和Wang等[23]分別在不同細胞發生凋亡的過程中發現，p-MST1或p-MST1/2的表達量顯著上升而MST1的表達量顯著下降。Lu 等[24]還發現在紫外線引起HaCat表皮細胞凋亡過程中，隨著紫外線作用時間的延長，MST1蛋白表達量逐漸降低，而分子量為34 kDa的MST1蛋白片段逐漸增多。MST1在多種凋亡刺激作用下，可被caspase-3切割成分子量為34 kDa的高活性促凋亡片段，該片段通過進入細胞核內磷酸化組蛋白H2B，從而使得染色質固縮、DNA損傷，最終導致細胞凋亡[25-26]。因此，分析本研究中MST1降低的原因可能有：(1)MST1發揮促凋亡的作用可能主要依賴于其磷酸化形式，故在p-MST1/2升高而MST1降低時細胞仍然能發生凋亡；(2)伴隨著caspase-3活性的增高，部分MST1經caspase-3切割活化，導致MST1蛋白呈逐漸降低趨勢。

綜上所述，NaAsO2可促進小鼠正常肝細胞AML12發生氧化應激和凋亡，在此過程中p-MST1/2、MST1及MST2蛋白表達水平出現異常。本研究僅初步驗證了砷對p-MST1/2、MST1及MST2蛋白表達水平的影響，還需深入探討MST1/2在砷致肝損傷過程中所調控的具體信號通路。