亞砷酸鈉對小鼠肝細胞AML12損傷的作用機制*

趙哲儀， 王正蓉， 方興艷， 王甜， 羅昭遜， 謝婷婷*

(1.貴州醫科大學附屬醫院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 醫學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學附屬醫院 產前診斷中心， 貴州 貴陽 550004； 4.山東省立第三醫院 檢驗科， 山東 濟南 250031； 5.貴州醫科大學 兒科學院， 貴州 貴陽 550004)

砷(arsenic，As)是一種分布廣泛且具有致癌作用的類金屬元素，被世界衛生組織認定為危害全球公眾健康的十大化學物質之一[1-2]。As及其化合物常通過皮膚系統、呼吸系統或胃腸道系統進入體內導致肝脂肪變性、肝纖維化、肝硬化及肝癌等一系列肝臟疾病[3-4]。盡管已有研究表明氧化應激、脂肪變性及凋亡過程參與As致肝損傷疾病的發生發展，但相關機制尚未完全闡明[5-6]。法尼醇X受體(farnesoid X receptor，FXR)與小異二聚體伴侶(small heterodimer partner，SHP)屬于核受體超家族成員，其所構成的信號通路不僅參與調節肝臟糖脂、膽汁酸等營養物質的新陳代謝，還與肝細胞氧化應激、凋亡密切相關[7-8]，但目前尚未見有關As影響肝細胞FXR-SHP信號通路的相關報道。因此，本研究以小鼠肝細胞株AML12為對象、亞砷酸鈉(sodium arsenite，NaAsO2)為處理因素，探究As對肝細胞氧化應激、脂肪變性、凋亡以及FXR-SHP通路的影響，以期為進一步闡明As致肝損傷機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源和主要藥物 小鼠正常肝細胞AML12(中國科學院細胞庫)，NaAsO2(美國Merck)。

1.1.2主要試劑和儀器 2.5 g/L胰蛋白酶溶液、DMEM/F-12培養基、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Corning公司)，青霉素和鏈霉素(美國Hyclone)，細胞凍存液、油紅O染色試劑盒、蛋白提取試劑盒及聚丙烯酰胺凝膠制備試劑盒(北京索萊寶)，化學發光試劑盒(美國Millipore)，TB Green Premix Ex TaqTMⅡ和Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(日本TaKaRa)，二辛可寧酸法(bicinchoninicacid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天)，兔抗小鼠FXR單克隆抗體(美國Novus)，兔抗小鼠SHP單克隆抗體(美國Affinity)，兔抗小鼠Bax單克隆抗體(武漢三鷹)，兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(英國Abcam)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養、NaAsO2處理及分組 AML12細胞于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM/F-12培養基中，5%CO2、37 ℃恒溫條件下培養；取處于對數生長期的AML12細胞接種于6孔板中，待細胞融合率達80%時，棄原培養基，換含0、10、15、20、25及30 μmol/L NaAsO2的培養基繼續培養24 h，對應設置為6個濃度組。以不含NaAsO2為對照組，其余各濃度為實驗組。

1.2.2化學比色法檢測細胞內丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量 消化收集各組細胞，按100 ∶1的比例加蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑提取各組總蛋白，并用BCA法檢測各組蛋白濃度；按照試劑盒說明書配制相應的MDA檢測體系，100 ℃水浴保溫60 min，10 000 r/min常溫離心10 min；吸取上清液200 μL于96孔板中，測定各組樣本于波長450、532及600 nm處的吸光度，并計算每克樣本質量中MDA的含量；每組樣本均設置3個復孔，并重復3次實驗。

1.2.3油紅O染色法檢測細胞內脂滴含量 各組細胞完成NaAsO2染毒處理后，棄去原培養基，PBS清洗細胞2次，按試劑盒說明書步驟對細胞進行固定及染色，加PBS覆蓋細胞于倒置顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image pro plus 6.0軟件分析細胞內脂滴光密度值。

1.2.4實時熒光定量PCR(reverse transcription realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)檢測細胞FXR和SHPmRNA表達 TRIzol法提取各組細胞的RNA，去除基因組DNA后合成cDNA。根據美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)提供的基因組序列設計引物(表1)，并按照試劑說明書配制RT-qPCR反應體系，反應條件設為 ∶95 ℃預變性2 min，95 ℃變性5 s、60 ℃退火及延伸30 s、共40個循環。擴增完成后進行熔解曲線分析產物特異性。以GAPDH和次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1)為雙內參基因，采用2-ΔΔCt計算出目的基因的相對表達量。每個樣本重復檢測3次，實驗同時設無反轉錄酶對照和非模板對照。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequence

1.2.5Western blot法檢測細胞FXR、SHP及Bax蛋白表達 按100 ∶1的比例配制蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑混合溶液提取各組細胞的總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣本與5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)上樣緩沖液按照1 ∶4比例充分混勻，置于100 ℃金屬浴中加熱8 min；各組蛋白均以上樣量40 μg進行SDS-PAGE電泳分離，再轉移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上；經50 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉2 h，吐溫-Tris鹽緩沖液(tris-buffered saline with tween20, TBST)洗膜3次、10 min/次，分別加兔抗小鼠FXR(1 ∶1 000)、SHP(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)及GAPDH抗體(1 ∶10 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次、10 min/次，加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次、10 min/次，采用化學發光(electrochemiluminescence，ECL)顯影；采用Image J軟件處理并分析圖像，以GAPDH為內參照計算各目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 MDA含量

化學比色法檢測各組AML12細胞內MDA含量發現，與對照組相比，10～30 μmol/L NaAsO2組AML12細胞內MDA含量升高(P<0.05)。見圖1。

注:(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與15 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(5)與25 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖1 各組AML12細胞中MDA含量Fig.1 The contents of MDA in hepatocyte AML12 of each group

2.2 脂滴含量

油紅O染色結果表明，對照組AML12細胞輪廓清晰、胞漿內只見少許的橘黃色脂滴，其余NaAsO2組AML12細胞輪廓模糊、胞漿內存在大量繞核分布的橘黃色脂滴；與對照組相比，15～30 μmol/L NaAsO2組AML12細胞內脂滴含量增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注:A為油紅O染色法檢測脂滴含量的結果(400×)，B為脂滴含量的定量結果；(1)與對照組比較，P<0.05。圖2 各組AML12細胞中的脂質含量Fig.2 The contents of lipid in hepatocyte AML12 in groups with different concentrations of NaAsO2

2.3 FXR和SHP mRNA的表達

RT-qPCR結果表明，與對照組相比，10～30 μmol/L NaAsO2組AML12細胞內FXR、SHPmRNA相對表達量下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

注:(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與15 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(5)與25 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖3 各組AML12細胞中FXR和SHP mRNA的表達Fig.3 Expression of FXR and SHP mRNA in hepatocyte AML12 with different concentrations of NaAsO2

2.4 FXR、SHP及Bax蛋白表達

Western blot結果顯示，與對照組相比，10～30 μmol/L NaAsO2組AML12細胞內FXR蛋白相對表達量降低(P<0.05)，20～30 μmol/L NaAsO2組AML12細胞內SHP蛋白相對表達量降低(P<0.05)，25～30 μmol/L NaAsO2組AML12細胞內BAX蛋白相對表達量增高(P<0.05)。見圖4。

注:A為Western blot檢測FXR、SHP及Bax蛋白的結果，B為FXR、SHP及Bax蛋白表達的定量結果；(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與15 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(5)與25 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖4 各組AML12細胞中FXR、SHP及Bax蛋白的表達Fig.4 Expression of FXR, SHP, and Bax proteins in hepatocyte AML12 with different concentrations of NaAsO2

3 討論

國內外已有研究發現，As可誘導肝細胞發生氧化應激、脂肪變性及凋亡，但其具體機制尚未闡明[9-11]。當機體發生氧化應激時，體內的氧化系統和抗氧化系統失衡會產生大量的活性氧使生物大分子發生過氧化從而導致組織細胞損傷[12]。此外，氧化應激還能通過促進脂質積累與細胞凋亡參與多種肝臟疾病的發生發展[13-14]。MDA是活性氧與生物膜的磷脂、膜受體相關的脂肪酸側鏈等大分子物質發生脂質過氧化反應而生成的產物，其含量對評價氧化應激損傷尤為重要[15]。Bax作為B細胞淋巴瘤-2家族的促凋亡分子，可通過增強線粒體的通透性使得大量凋亡因子被釋放，從而激活凋亡執行程序[16]。本研究通過體外構建As暴露肝細胞模型發現，隨著NaAsO2質量濃度的增加，AML12肝細胞內MDA、脂滴含量及Bax蛋白相對表達量逐漸增加，提示As可以明顯誘導AML12肝細胞發生氧化應激、脂肪變性及凋亡。

FXR和SHP均屬于核受體超家族成員，在肝臟、胃腸道中表達豐富[17-18]。FXR作為配體依賴性的轉錄因子可通過結合SHP基因啟動子區域的FXR結合位點，促進SHP基因的轉錄表達[19-20]。研究發現，FXR-SHP通路不僅可抑制肝臟脂肪的合成、降低肝臟中甘油三脂的含量，還與細胞氧化應激、凋亡存在密切聯系[21-23]。在多種不同細胞系的研究中均發現，FXR和SHP能通過上調抗氧化酶以抵御氧化應激損傷[24-25]。而FXR和SHP在細胞凋亡中的作用存在爭議，Lv等[23]發現FXR和SHP在胃癌上皮細胞中的表達量高于正常上皮細胞，且通過抑制FXR信號通路可使促凋亡分子半胱氨酸蛋白酶3和BAX的表達量升高。Haga等[26]發現激活FXR可上調SHP及抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2、B細胞淋巴瘤-xL的表達，從而抑制肝細胞發生凋亡；但Miyazaki等[27]發現上調FXR和SHP的表達可促進結腸腺癌細胞發生凋亡。本研究結果顯示，NaAsO2可致AML12細胞中FXR、SHP的mRNA及蛋白表達量下調，提示As可能通過下調FXR-SHP信號通路，影響與氧化應激、脂代謝及凋亡相關靶基因的表達，從而導致肝損傷，但具體生物學機制有待深入研究。

綜上所述，NaAsO2能導致AML12細胞發生氧化應激、脂肪變性及凋亡，其機制可能與As抑制FXR、SHP的表達相關。本研究僅初步探討了FXR-SHP信號通路在As致肝損傷中的表達變化，還需利用干預實驗進一步驗證該信號通路在As致肝損傷過程中的具體作用。