胰激肽原酶對他克莫司誘導腎損傷的保護作用*

張隆業 劉維萍 張彥芬 郭永力 管仁蘋 邵雪 王兆宇 李燦

(1.秦皇島市第一醫院腎臟內科，河北 秦皇島 066000；2.秦皇島市第一醫院藥學部，河北 秦皇島 066000；3.延邊大學附屬醫院腎臟內科，吉林 延吉 133000)

他克莫司(tacrolimus, TAC)是一種廣泛使用的維持性免疫抑制劑，但長期使用會引起相當大的腎毒性[1-4]。TAC造成不可逆的腎損傷與小動脈透明變性和增厚，血管收縮和缺血，間質纖維化，細胞凋亡和萎縮[5-6]。TAC誘導的腎毒性的發病機制仍不清楚，其分子機制可能與細胞凋亡、氧化應激、炎性介質等多種因素直接相關，往往各種機制間相互刺激相互協調，共同導致了腎毒性的發生[7-9]。胰激肽原酶(pancreatic kallikrein，PK)屬于激肽釋放酶-激肽系統類物質，在人體多個部位具有較強的表達能力，與血管中的活性物質相遇后會產生作用效應，對腎臟功能具有一定的調節作用。臨床中使用的胰激肽原酶對慢性腎臟病具有良好的治療效果，對糖尿病腎病、藥物相關腎損傷以及腎病綜合征均有保護作用。但對TAC誘導的腎損傷無明確作用，分子機制也無具體研究[10-11]。本課題通過對TAC誘導的腎小管上皮細胞來研究PK對其保護作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 HK-2細胞培養及分組 HK-2細胞使用培養基DMEM/F12加入10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗(P-S)青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL，培養條件37℃、5%CO2。從液氮中取出HK-2的凍存細胞，迅速放置于37℃水浴箱中復蘇細胞；離心管中準備適量培養液(8～10 mL)，將HK-2細胞液移入離心管中；1000 rpm離心3 min，棄去上清，加入適量培養液制成細胞懸液，轉移至培養皿中繼續培養，在細胞呈單層生長達80%時則進行傳代。收集對數生長期細胞制成細胞懸液，用細胞計數板對其進行計數，計算好鋪板時每孔所需的細胞個數，用適當量的培養基液體加入，繼續培養。將各組細胞按照1×104/孔的標準，在一致培養條件下，在96孔板上進行細胞接種。并在24小時內分別使用對應藥物，然后將HK-2細胞劃分為對照(CON)、TAC(50 μg/mL)、PK(6 pg/mL)、TAC+PK(6 pg/mL+50 μg/mL)組，第二天進行后續實驗。

1.2 HK-2細胞活力檢測 每個孔中加入的CCK-8溶液劑量為10 μL，相同條件孵育3 h，在450 nm吸光度條件測OD值。

1.3 HK-2活性氧檢測 將各組細胞以2×105/孔接種于6孔板，在溫濕度為37℃、5%CO2的環境下進行時長24 h的培養將10 μmol/L DCFH-DA染料滴注在6孔板細胞中，靜待孵育30 min(溫度為37℃)；采用PBS對細胞進行清潔處理，滴注0.25%胰酶消化，在離心機上進行3次重懸；采用PBS再次清洗細胞，過濾廢棄液體。采用流式細胞儀觀察1 mL PBS稀釋細胞顆粒團活力。

1.4 免疫印跡法檢測 采用免疫印跡法檢測4組細胞，LC3B、Bcline、Bcl-2、Bax蛋白表達水平。

2 結果

2.1 四組HK-2細胞活力比較 與CON組比較，發現TAC組的細胞活力快速下降(P<0.05)；TAC+PK組細胞活力較高，且顯著大于TAC組(P<0.05)，見圖1。

圖1 四組HK-2細胞活力測定

2.2 四組HK-2細胞的ROS比較 在細胞ROS表達能力的檢測方面，將二氯二氫熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)熒光檢測法與流式細胞法進行組合使用。TAC組的細胞ROS表達能力要顯著優于CON組、TAC+PK組 (P<0.05)，見圖2、3。

圖2 四組的細胞ROS數量對比分析

圖3 四組HK-2的ROS生成量

2.3 四組HK-2細胞蛋白水平比較 與CON組相比，TAC組LC3B-Ⅱ表達增加(P<0.05)；與TAC相比，TAC+PK組LC3B-Ⅱ表達減少(P<0.05)；與CON組相比，TAC組Beclin表達增加(P<0.05)；與TAC相比，TAC+PK組Beclin表達減少(P<0.05)，見圖4。與CON組相比，TAC組腎小管細胞中Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)；與TAC組相比，TAC+PK組Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)，見圖5。

圖4 腎組織細胞的LC3B/Beclin蛋白ROS能力監測及蛋白表達對比分析

圖5 四組細胞的Bcl-2、Bax蛋白表達及檢測值分析

3 討論

PK抗氧化功能與自噬的自我保護功能已經被多位學者提及[12-13]。Hisamura等[14]通過大量研究證實TAC對于細胞的ROS表達具有正向的促進作用，能夠抑制細胞組織中的氧化磷酸化反應過程，提高氧化反應的抵抗能力和防御能力，使抗氧化應急反應水平下降，最終造成近端的小管細胞產生炎性反應或逐漸凋亡。Zhou等[15]研究發現TAC對細胞的死亡具有誘導作用，且細胞的ROS表達能力和TAC劑量存在顯著的相關性，細胞中滴注氧化氫酶、N-乙酰半胱氨酸之后，實現了TAC介導過程的抑制，使細胞ROS下降，TAC對細胞死亡的誘導能力下降。本文通過研究證實了TAC組細胞ROS水平與細胞活力水平存在負相關性，即細胞活力較高時，細胞的ROS較低，反之則較高；通過對細胞的PK干預使細胞活性能力得到提高，ROS顯著下降。上述結果表明TAC可通過促進細胞氧化應激反應，PK可以顯著抑制TAC誘導的氧化應激反應進一步保護HK-2細胞。

腎小管上皮細胞的代謝效率會隨著腎臟氧氣消耗速度的加快而同步提高，細胞的自噬有對腎小管細胞環境穩定性、細胞活力水平、細胞生理功能等方面具有正向的激勵作用。有研究證實細胞自噬現象對腎功能藥物損傷、糖尿病腎病、梗阻性腎病均具有良好的保護作用[16]。同時，在開展體外組織細胞培養實驗的過程中，采用免疫印跡法對HK-2細胞中的LC3B表達功能和Beclin表達功能進行檢測，發現TAC組的LC3B-Ⅱ表達功能和Beclin表達功能均有所提高，PK組的LC3B-Ⅱ和Beclin表達功能有所下降。在電子顯微鏡的觀察下，HK-2細胞免疫印跡結果和腎小管上皮細胞的自噬體形成過程具有較高的一致性。Lim等[17]在研究中發現TAC誘導引發的損傷主要是因為白蛋白運行阻力增大、細胞自噬空泡量增加，溶酶體出現損傷。在電子顯微鏡下的典型表現為近端小管中有大量自噬空泡，腎組織與腎小管的P62水平升高、Beclin蛋白表達能力升高、LC3BⅡ/Ⅰ比值顯著增大，Klotho基因治療可以通過提高溶酶體活力促進改善TAC誘導的的自噬體的清除障礙，減少超負荷蛋白及自噬空泡的聚集，進一步調節自噬發揮腎臟保護作用，與本研究結果具有較高的相似性。研究有發現非急性CsA腎損傷與自噬空泡數量增多，以及自噬清除功能衰退存在顯著的相關性，典型特征為自噬空泡數量異常，LC3B-Ⅱ和Beclin的表達數量顯著增多。自噬清除減少則表現為P62表達增加，使用腎臟保護藥物干預后自噬功能障礙可明顯改善[18]。Xu等[19]通過電子顯微鏡觀察高糖培養液中的 HK-2 細胞變化，發現細胞數量增長速度較快，且Beclin表達能力下降，但LC3B-Ⅱ表達能力增強、P62水平顯著下降。

細胞自噬現象對腎臟損傷造成的影響備受研究者們的重視，現有的研究結果尚不統一。研究報道指出，自噬在各種原因造成的腎功能損傷中，均能夠發揮一定的腎組織功能保護作用[20]，但是目前尚無關于直接提高自噬的方法來證明自噬的作用報道，通過進一步的研究，PK有望成為改善自噬的重要手段。對細胞凋亡或壞死具有影響作用的因素較多。有文獻報道，TAC通過細胞凋亡誘導細胞死亡[21-22]。考慮到上述PK對細胞活力的保護作用，本課題組對PK與HK-2細胞凋亡的相關性進行了分析和探討，并運用免疫印跡檢測法對細胞凋亡的分子表達進行檢測，發現TAC組的Bcl-2表達有所下降，Bax的表達有所增強，TAC+PK組Bcl-2表達顯著高于TAC組，Bax表達較低。體外研究結果顯示，腎組織細胞凋亡與ROS密切相關[23]，TAC誘導的大鼠腎損傷模型在出現腎小管細胞凋亡的同時出現腎氧化應激水平增高，凋亡增加同時伴隨著氧化應激水平的進一步增高，凋亡和氧化應激水平的此種同向變化提示TAC誘導的腎小管上皮細胞凋亡增加( Bcl-2蛋白表達的減少及Bax的增多)可能與其下調氧化應激反應增強有關。本次研究發現LC3B-Ⅱ體內實驗與體外實驗結果截然相反，目前考慮與腎組織細胞群體的不均一性，Beclin、P62等指標相互影響作用及細胞外因素(激素水平、離子濃度等)作用有關，尚有待進一步研究。但二者之間是否存在因果關系，其具體作用通路如何，尚有待進一步研究。

4 結論

胰激肽原酶對他克莫司誘導腎小管上皮細胞具有保護作用，其機制與胰激肽原酶抑制抗氧化應激及調節自噬有關。