嵌合抗原受體T細胞治療膠質母細胞瘤的研究進展

吳 勇綜述 黃書嵐審校

作者單位：430060 武漢，武漢大學人民醫院神經外科（吳 勇、黃書嵐）

膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是成人最常見的顱內原發性惡性腫瘤，中位生存期約15 個月[1]。目前，新診斷的GBM 標準治療包括最大化安全切除、替莫唑胺化療聯合同步放療等[2]。即使采用綜合治療，很短時間內仍不可避免地出現復發，預后不良。由于腫瘤的異質性、化療耐藥性、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）等因素，使得GBM 的傳統治療面臨巨大的挑戰。近年來，嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T-cells，CAR-T）療法在治療GBM 中取得許多進展。本文介紹CAR-T 治療GBM的最新研究進展以及面臨的挑戰。

1 CRA-T治療機制

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）是特殊的人工蛋白，分為細胞外、跨膜區及細胞內三部分，其中胞外部分具有特異性結構域可以識別腫瘤表面相關抗原，而且不需要依賴主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）的介導，從而避免了腫瘤通過下調MHC 進行免疫逃逸；跨膜結構域將胞外與胞內結合為一體，起到信息傳遞的作用；而胞內部分包含酪氨酸酶活化序列，可激活T細胞毒性及增殖，發揮靶向性的抗腫瘤效果[3]。

經過更新迭代，CAR 不斷完善。第1 代CAR 胞內僅有1個T細胞信號結構，只能簡單識別靶細胞及活化T 細胞，因此在體內存活時間短，抗瘤作用甚微。第2 代CAR 在第1 代的基礎上增加了1 個共刺激分子信號（如CD27、CD28、OX40、4-1BB等），實現了共刺激分子、胞內信號域的雙重活化，使T細胞可以自我增殖，并釋放一些增強細胞功能的因子。第3 代CAR 同時擁有2 個共激分子，T 細胞可持續增殖，明顯增強了殺傷腫瘤的作用。第4 代CAR 加入了更多的功能元件，包括可控開關、自殺基因、增強T細胞功能的分子等。

2 CAR-T治療GBM的可行性和優勢

美國食品和藥物管理局在2017 年批準了兩款CAR-T用于血液惡性腫瘤的臨床治療。鑒于CART 在血液系統腫瘤中突出的療效，越來越多的研究將CAR-T用于實體腫瘤治療。

顱內淋巴管的發現以及效應T 細胞運輸的研究，使得中樞神經作為免疫特區的概念被推翻，使GBM 的免疫治療有了理論基礎[4]。腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）與腫瘤相關抗原的豐度呈正相關。由于膠質瘤的TMB相對較低，新抗原不足以使T細胞識別腫瘤；并且，GBM初級免疫應答的產生受到抗原特異性T細胞受體信號傳導和抗原非依賴性共刺激信號傳導缺陷的限制。而CAR構建體包含有共激結構域，不需要刺激初級免疫應答。膠質瘤干細胞（glioma stem cells，GSCs）對放、化療不敏感，是治療失敗的關鍵原因。CAR-T 療法對GSCs有效，并有根除這類細胞的希望。

3 CAR-T在GBM中的具體應用

3.1 IL-13Rα2 CAR-T 細胞IL-13Rα2 的表達與膠質瘤的級別呈正相關，超過70%的GBM 呈過表達，正常腦組織幾乎不表達。高表達IL-13Rα2，激活Src/PI3K/Akt/mTOR 信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉移[5]。IL-13Rα2是細胞因子IL-13受體中的2 個亞基之一，IL-13 以低親和力結合IL-13Rα 1，隨后IL-13Rα1 與IL-4Rα形成異二聚體，激活STAT6信號通路，誘導細胞凋亡。IL-13Rα2以較高的親和力結合IL-13，是一種誘餌受體，為腫瘤細胞的凋亡逃逸機制。

2015年，Brown等[6]通過術后瘤腔給予第一代靶向性IL-13Rα2 的CAR-T 治療復發性GBM 共3 例，最長存活時間約14 個月，其中2 例有客觀的影像學表現，出現的頭痛和短暫神經功能缺損等不良事件可控制；第一代IL-13Rα2 CAR-T 在體內存活時間約14 d，缺乏持久性。2018 年，Brown 等[7]在前期的基礎上進行了優化，開發出第二代IL-13Rα2 靶向CAR-T，稱為IL-13BBζT，減少脫靶細胞受體的相互作用，增加了細胞內信號傳導結構CD137（4-1BB），同時加入用于細胞追蹤和富集的截短信號CD19（CD19t）；小鼠模型實驗表明IL-13BBζT 比第一代CAR-T 擁有更高、更持久抗腫瘤效應，并未出現明顯的毒性反應，還發現腫瘤局部給藥途徑似乎更優于靜脈內全身給藥。有臨床試驗報道[8]，瘤腔內先后6 次輸注第二代IL-13Rα2 CAR-T 治療1 例復發的多灶GBM，在輸入部位未見腫瘤生長，后因顱內其他部位和脊髓新發腫瘤進行10次腦室內給藥，第三次腦室給藥后觀察到所有顱內和脊髓腫瘤均明顯縮小。Keu等[9]用18F-9-[4-氟-3-（羥甲基）丁基]鳥嘌呤PET分子顯像研究過繼到體內CD8+毒性T淋巴細胞，把單純皰疹病毒1 型胸苷激酶作為酶報告基因標記到IL-13Rα2 CAR-T 中，該方法能準確地監測CAR-T細胞活力、生物分布、運輸過程等。

3.2 表皮生長因子受體Ⅲ型突變體（epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ，EGFRvⅢ）靶向CAR-T EGFR 是一種酪氨酸激酶受體，在許多腫瘤中表達失調。EGFRvⅢ是最多見的突變體，缺乏與胞外配體相結合的結構域，因此，該酪氨酸激酶受體不再依賴配體，可以持續激活多條下游的信號通路（如PI3K、Ras 等），從而引起腫瘤細胞增殖、血管新生、侵襲等一系列反應[10]。EGFRvⅢ在約30%的GBM 中呈陽性表達，而在正常組織中無表達，因此成為治療GBM的安全可行的有效靶點。

Morgan 等[11]開發了第三代EGFRv Ⅲ靶向性CAR-T，以CD28-41BB-CD3ζ作為T 細胞信號傳導結構域，可特異性識別GSCs 和膠質瘤細胞系，并對培養的正常組織細胞無影響。在GBM模型小鼠中，EGFRvⅢ靶向性CAR-T 可以有效通過BBB 到達腫瘤區，表現出抗腫瘤功效[12]。鄭巖等[13]也成功構建了第三代EGFRvⅢ靶向性CAR-T，對EGFRvⅢ陽性U87 膠質瘤細胞有特異殺傷效果。O'Rourke 等[14]首先進行EGFRvⅢ靶向性CAR-T的臨床試驗，靜脈輸注EGFRvⅢ靶向性CAR-T 治療復發性GBM 共10例，部分病人出現腫瘤外毒性和細胞因子釋放綜合征，中位生存期為8 個月，1 例無進展生存期達到18個月以上。大多數EGFRvⅢ陽性GBM 在復發時維持EGFRvⅢ陽性，而一部分病人卻發生變化，因此對于接受EGFRvⅢ靶向治療的GBM病人，建議重復活檢并重新評估EGFRvⅢ狀態[15]。目前，EGFRvⅢ靶向性CAR-T 治療復發性GBM 療效和安全性的臨床試驗（NCT02209376、NCT01454596）仍在進行中。

3.3 人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）靶向CAR-T HER2 是一種跨膜糖蛋白，屬于EGFR 家族，HER2 致癌基因存在于編碼HER2 蛋白的17 號染色體的長臂，可以通過多個信號通路影響細胞增殖和凋亡。HER2 表達與GBM的預后有著密切關系[16]，因此，HER2是GBM病人CAR-T 治療的另一個重要靶點。但是有案例報道顯示，1例轉移性腸癌接受CAR-T療法后死亡，原因是CAR識別肺上皮細胞中低水平表達的HER2所致，因此其安全性受到關注[17]。

Ahmed等[18]通過編碼HER2的逆轉錄病毒載體，轉導活化T 細胞獲得HER2 靶向性CAR-T，發現HER2 靶向CAR-T 可殺死HER2 陽性GBM 細胞和CD133陽性干細胞，具有顯著抗腫瘤活性。HER2靶向CAR-T 的一期臨床試驗（NCT01109095）已經完成[19]，17例均是HER2陽性復發性或進展性GBM，通過靜脈給予HER2靶向CAR-T，1例出現超過9個月的部分反應，7例具有8周至29個月的無進展期，治療后和診斷后的中位生存期分別為11.1 個月、24.5個月，試驗未觀察到劑量限制性毒性，2 例出現2 級癲癇和/或頭痛。

3.4 酪氨酸蛋白激酶受體2（ephrinA2 receptor EphA2）靶向CAR-T EphA2 在許多腫瘤中過表達，EphA2與相應的配體結合后通過Ras/ERK和PI3/Akt途徑調節細胞增殖及凋亡。EphA2 在大部分GBM中呈過表達，并且與預后相關，使其成為治療GBM的極具吸引力的靶點[20]。

Chow 等[21]研究發現EphA2 靶向CAR-T 可以誘導產生γ-干擾素和白細胞介素（interleukin，IL）-2，對腫瘤細胞具有顯著的細胞毒性；12只模型小鼠顱內注入2×106個EphA2 靶向CAR-T 后，生物發光成像顯示腫瘤信號明顯減弱，小鼠存活時間延長；降低輸入的EphA2 靶向CAR-T 細胞數后也發現了抗腫瘤效應，但是通過靜脈途徑輸入方式未觀察到抗腫瘤作用。有學者對EphA2特異性CAR進行修飾，獲得優化的EphA2靶向CAR-T，抗腫瘤活性增加了20倍[22]。 EphA2 靶 向 CAR- T 的 臨 床 試 驗（NCT02575261）已經完成，目前未公布試驗數據。

4 CAR-T治療GBM面臨的挑戰與方向

4.1 抗原異質性與抗原逃逸GBM 抗原異質性是免疫治療耐藥的主要原因。IL-13Rα2 靶向CAR-T 和EGFRvⅢ靶向CAR-T 治療后均發現靶向抗原的丟失，腫瘤進展[4，15]。有學者設計了HER2和IL-13Rα2的雙靶點CAR-T，發現具有更有效的識別腫瘤能力和更加持久的抗瘤活性[23]。目前，已經研究出三價CAR-T，可以克服抗原異質性，并改善治療效果[24]。4.2 腫瘤微環境 腫瘤微環境存在很多因素抑制T細胞的應答，為了應對微環境產生的免疫抑制因子，例如TGF-β、IL-6、IL-10、IL-23等，一種方法是開發小分子抑制劑和相應的抗體。GBM 會累積許多抑制性白細胞，如調節性T 細胞、髓樣抑制細胞、腫瘤相關巨噬細胞等，用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子中和髓樣抑制細胞，通過節律化療、阻斷CD25 等方法抑制調節性T 細胞作用。目前，免疫檢查點抑制劑可明顯提高免疫治療的效果[25]。

4.3 安全性與BBB CAR-T 的毒性主要包括腫瘤溶解綜合征、細胞因子釋放綜合征、神經毒性、靶標毒性等，安全性是免疫治療首要考慮的。目前，有研究將分子開關、自殺基因導入到CAR 中，增強CAR-T的安全性。為預防“細胞因子風暴”，有學者用化學分子開關將CAR 的抗原識別部分和信號傳導部分分開，只有在小分子配體（AP21967）存在時被激活[26]，如此依據AP21967的劑量和作用時間來調節T細胞的毒性和細胞因子的釋放。BBB的存在使通過外周血進入腫瘤的效應T細胞不足10%，是限制CART療效的重要原因。提高BBB的通透性和改變輸注途徑可以明顯改善抗瘤效應[7]。

綜上所述，CAR-T療法給GBM治療提供了一個新的研究方向，但是仍需要進一步研究GBM的分子機制，尋找最優的靶點，設計更多靶點、通用型、增強型的CAR-T，以及聯合其他治療方法。