胞外囊泡源性miRNA在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中作用的研究進(jìn)展

王明明 唐瑞天綜述 劉建雄審校

作者單位：730000 蘭州，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)（王明明）；730000 蘭州，甘肅省人民醫(yī)院神經(jīng)外科（唐瑞天）；750000 銀川，寧夏醫(yī)科大學(xué)（劉建雄）

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、最具侵襲性、預(yù)后較差的原發(fā)性惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的50%～60%。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）屬于腦膠質(zhì)瘤的一種，WHO 分級(jí)Ⅳ級(jí)，惡性程度最高，即使積極手術(shù)聯(lián)合放化療，GBM 治療效果仍然不佳，平均生存期大約17 個(gè)月[1]。本文就細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）源性微小RNA（micro-RNA，miRNA）的生物學(xué)特性及其在GBM 中的作用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 EV的生物特性

EV是一類起源于細(xì)胞膜的微小顆粒，來(lái)源于激活CD4+和CD8+T 細(xì)胞抗原提呈細(xì)胞，依據(jù)起源、大小以及組成可分為凋亡體、外泌體、微泡、癌小體。凋亡體是最大的EV，大小1 000～5 000 nm，可促進(jìn)細(xì)胞的程序性死亡。外泌體是一種最小的囊泡，通過(guò)質(zhì)膜的外向出芽所形成，CD3 和CD9 被認(rèn)為在外泌體形成中起關(guān)鍵作用[2]，直徑30～100 nm，形態(tài)大致為杯狀；也可起源于內(nèi)體膜的內(nèi)向出芽，多個(gè)的外泌體聚集形成多泡體。微泡起源于膜蛋白富積的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域，最具特征的外泌體能夠在細(xì)胞間進(jìn)行信息交流，不僅在正常生理過(guò)程中起重要的作用，也參與病理的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)行信息交流的物質(zhì)有蛋白質(zhì)、DNA、miRNA、mRNA、脂質(zhì)和非編碼RNA 等。癌小體，直徑1～10 μm，起源于膜泡脫落，其中細(xì)胞角蛋白18 最為富集[3]，含有大量的參與局部侵襲的生物活性分子，與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。

腦組織分泌的EV參與神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞之間的信息傳遞，調(diào)節(jié)血腦屏障的形成，以及神經(jīng)系統(tǒng)的功能和神經(jīng)再生等。GBM 中EV 含有miRNA 信號(hào)，有小部分反映腫瘤細(xì)胞起源的miRNA，也有少量miRNA 在腫瘤EV 中特異性富積。3'端腺苷化的miRNA 在細(xì)胞中相對(duì)富集，而3'端尿苷化的miRNA主要存在于EV中。

2 miRNA的生物特性

miRNA 屬于一種家族性的微小非編碼RNA，大小約22 個(gè)核苷酸，可調(diào)控多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞周期和組織發(fā)育[4]。miRNA 主要通過(guò)減少目的基因的表達(dá)，減少互補(bǔ)結(jié)合的mRNA 的3'端非編碼區(qū)，導(dǎo)致mRNA 的快速衰變或阻止編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)。miRNA 由RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，PolⅡ）通過(guò)蛋白編碼基因或者內(nèi)含區(qū)序列轉(zhuǎn)錄而來(lái)。雖然初級(jí)轉(zhuǎn)錄體通過(guò)DGosha-DGCR8 復(fù) 合 物，繞 過(guò)RNase Ⅲ，將 原 始miRNA切割為大小約70個(gè)核苷酸的莖環(huán)樣前體；再由RNase Ⅲ酶DICER1進(jìn)一步加工成具有22個(gè)核苷酸的雙鏈miRNA，之后不穩(wěn)定的miRNA雙鏈加工修飾變成穩(wěn)定的成熟單鏈miRNA。

成熟miRNA 生成并裝載到argongaute 效應(yīng)蛋白中，形成miRNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物的核心，識(shí)別并結(jié)合mRNA 3'非編碼區(qū)，通過(guò)seed 序列互補(bǔ)介導(dǎo)基因沉默[5]或抑制表達(dá)，促進(jìn)miRNA 靶點(diǎn)降解。由于mRNA 靶向的復(fù)雜性，miRNA 可以靶向很多個(gè)不同的mRNA。因此，單獨(dú)的一個(gè)miRNA 就能夠有規(guī)律性的調(diào)控復(fù)雜的生物過(guò)程。

3 EV與受體細(xì)胞的相互作用

研究表明，受體細(xì)胞在體外和體內(nèi)都對(duì)EV有很強(qiáng)的吸引力，EV似乎只是與它們特定識(shí)別的細(xì)胞相互作用。腫瘤來(lái)源的EV被器官特異性細(xì)胞內(nèi)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移前的微生態(tài)改變[6]。EV與受體細(xì)胞相互作用的性質(zhì)很關(guān)鍵，能通過(guò)直接刺激受體表面的受體而激發(fā)信號(hào)，并不需要進(jìn)入受體細(xì)胞[7]。EV也可以直接與受體細(xì)胞的質(zhì)膜融合，將其內(nèi)容釋放到細(xì)胞質(zhì)中。這種細(xì)胞間轉(zhuǎn)移通過(guò)致癌受體導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)異常，進(jìn)而導(dǎo)致受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。因此靶細(xì)胞可通過(guò)內(nèi)吞作用把EV內(nèi)化，但需要一個(gè)初始受體介導(dǎo)的結(jié)合步驟，然后達(dá)到內(nèi)部化效應(yīng)。在GBM的EV中，這種結(jié)合至少在一定程度上由硫酸肝素鈉蛋白多糖介導(dǎo)。一旦內(nèi)吞，EV可以通過(guò)與膜融合釋放其在細(xì)胞質(zhì)中的包含物，也可以通過(guò)相鄰細(xì)胞間的連接，在細(xì)胞之間傳遞信號(hào)。

4 EV源性miRNA對(duì)微環(huán)境的調(diào)控

在GBM 中，EV 富集于幾種致癌miRNA，包括miR-21、miR-23a、miR-30a、miR-221 和miR-451。在GBM 細(xì)胞間信息的傳遞過(guò)程中，EV 介導(dǎo)的致癌miRNA 可能是調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和生存的重要機(jī)制。同時(shí)，GBM 中EV 源性miRNA 可以轉(zhuǎn)移到微環(huán)境中的非惡性細(xì)胞中，改變其表型，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。van der Vos 等[8]發(fā)現(xiàn)GBM 中EV 與小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用，傳遞miR-21、miR-451；小膠質(zhì)細(xì)胞暴露于GBM的EV中，受體細(xì)胞中兩種miRNA水平升高，導(dǎo)致共同靶細(xì)胞原癌基因水平降低。

在GBM進(jìn)展過(guò)程中，缺氧環(huán)境可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)通路的激活，導(dǎo)致mRNA和蛋白富積EV的產(chǎn)生。EV介導(dǎo)GBM和內(nèi)皮細(xì)胞之間的缺氧依賴性細(xì)胞間通信，導(dǎo)致腫瘤新生血管的強(qiáng)烈激活。因此，EV組成的變化及其在缺氧環(huán)境下的影響可能是由于GBM細(xì)胞中miRNA信號(hào)的改變。有研究表明，在缺氧過(guò)程中，miR-210 可以通過(guò)EV 分泌，直接影響內(nèi)皮細(xì)胞的反應(yīng)。細(xì)胞miRNA 表達(dá)的變化可能在miRNA和蛋白組mRNA水平上影響EV的組成。

5 miRNA在GBM病理生理中的作用

GBM的miRNA表達(dá)失調(diào)，如miR-221表達(dá)顯著上調(diào)，miR-128、miR-181a和miR-181b表達(dá)下調(diào)，其中miR-181a 的下調(diào)會(huì)降低膠質(zhì)瘤對(duì)放療的敏感性。同時(shí)，miRNA 影響多種細(xì)胞和分子途徑，如調(diào)控胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3、金屬蛋白酶組織抑制因子等，進(jìn)一步參與GBM的病理生理過(guò)程。

miRNA 可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)移和沉默在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。有研究提示多種miRNA 在調(diào)控GBM 的發(fā)展和進(jìn)程中具有致癌和抑癌的作用，如miR-543 通過(guò)金屬蛋白酶-9調(diào)控GBM，起到抑癌作用[9]。GBM叉頭蛋白M1的表達(dá)與miR-876-5p 呈負(fù)相關(guān)，叉頭蛋白M1 的下調(diào)導(dǎo)致miR-876-5p過(guò)表達(dá)，其抑癌作用更明顯[10]。GBM惡性增殖失控等顯著特征的發(fā)生，不只是蛋白質(zhì)編碼基因信號(hào)通路的失活，也可能是基因間miRNA介導(dǎo)相互作用異常所導(dǎo)致。

6 miRNA對(duì)血管生成的調(diào)控

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體是腫瘤誘導(dǎo)血管生成的重要介質(zhì)，如血管抑制素、內(nèi)皮抑制素、血栓反應(yīng)蛋白-1、血栓反應(yīng)蛋白-2等。血管的生成是內(nèi)皮細(xì)胞向微血管中萌發(fā)，為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)與氧氣的過(guò)程。血管生成與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面成正相關(guān)，有基礎(chǔ)作用，更具有促進(jìn)作用。腫瘤的缺氧環(huán)境易誘導(dǎo)腫瘤血管的生成。在新的血管形成過(guò)程中，間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為周細(xì)胞，最后遷移形成新的血管。然而間充質(zhì)干細(xì)胞在GBM 中的血管生成和miRNA修飾機(jī)制尚不清楚[12]。有研究表明miR-299參與GBM血管生成過(guò)程，牛磺酸上調(diào)因子1通過(guò)直接與miR-299結(jié)合調(diào)控腫瘤血管的生成[12]。miR-137 可通過(guò)直接靶向組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶的增強(qiáng)子，調(diào)控GBM的血管生成[13]。

7 miRNA對(duì)代謝的調(diào)控

代謝與腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)。miR-451 可作為GBM代謝和侵襲的強(qiáng)有力調(diào)控因子[14]。在高糖環(huán)境中，miR-451 在GBM 中保持高水平的表達(dá)，且通過(guò)直接靶向激活腺苷酸活化蛋白激酶的肝激酶B1，是腺苷酸活化蛋白激酶復(fù)合物的有效抑制劑。GBM 很顯著的特征之一是有氧糖酵解，也被稱為Warburg 效應(yīng)。miRNA是一個(gè)控制細(xì)胞代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的關(guān)鍵性調(diào)控因子，可通過(guò)兩種方式調(diào)節(jié)GBM糖酵解代謝。首先，miRNA 可直接調(diào)控GBM，參與糖攝取和糖代謝基因的表達(dá)，如miR-106a抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3，促進(jìn)糖酵解，提高葡萄糖通量。miRNAlet-7a 抑制M2 型丙酮酸激酶[15]，導(dǎo)致上游糖酵解中間體的積累。另外miRNA 可通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 和RAS 通路調(diào)控受體酪氨酸激酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，間接調(diào)控糖酵解。

8 EV源性miRNA作為GBM生物標(biāo)志物

單個(gè)多個(gè)microRNA 在腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境中調(diào)控基因表達(dá)，可能是監(jiān)測(cè)GBM復(fù)發(fā)和化療反應(yīng)的非常有價(jià)值的生物標(biāo)志物。然而，最常用的檢測(cè)手段活檢術(shù)對(duì)GBM 腫瘤的異質(zhì)性檢測(cè)準(zhǔn)確度不高。在人的血液[16]、唾液、腦脊液、滑液、房水[17]等體液中可檢測(cè)到EV，可作為診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。miR-21為GBM 中上調(diào)最多的miRNA 之一，通過(guò)誘導(dǎo)與caspase3活性，降低相關(guān)促凋亡蛋白表達(dá)，保護(hù)GBM細(xì)胞免受替莫唑胺誘導(dǎo)的凋亡。Qu 等[18]在meta 分析中指出，細(xì)胞外的miR-21可作為診斷腦腫瘤的生物標(biāo)志物，其具有一定的準(zhǔn)確性。

綜上所述，EV 源性miRNA 在受體細(xì)胞中的攝取和處理的機(jī)制尚不清楚，但在GBM 的生長(zhǎng)、侵襲過(guò)程中具有重要作用。