基于生物信息學的銀屑病基因集富集及免疫細胞浸潤分析

周 揚，韓 露，方如男，趙 艷，郭 楊，翟 燁，李 萍，李建紅

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；3.北京中醫醫院，北京 100010）

銀屑病（Psoriasis）是一種遺傳與環境共同作用的免疫介導的慢性、復發性、炎癥性、系統性疾病，發病機制目前尚不完全清楚［1］。銀屑病易于復發、影響美觀、可伴發代謝綜合征等系統性疾病，嚴重影響了患者的生活質量。對銀屑病有效治療靶點的探索一直是皮膚科領域研究的熱點和重點。

近年來，生物信息學越來越多的應用于包括銀屑病在內的自身免疫相關的疾病的發病機制研究。有研究者對篩選出的銀屑病差異基因進行了基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes，KEGG）富集研究，然而這種方法可能會遺漏某些差異不顯著但功能重要的基因［2］。目前對于免疫細胞的研究也局限于T 淋巴細胞、肥大細胞等幾個種類，尚需全面系統的揭示參與銀屑病發病的多種免疫細胞的浸潤和作用機制。

本研究應用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）進行全基因組表達分析，根據基因表達與類別之間的相關性對基因進行排名，篩選出在銀屑病中上調的基因集和通路［3］。同時，利用CIBERSOFT 反卷積算法進行22 種免疫細胞浸潤分析，分析銀屑病中各類免疫細胞之間的相互作用，以期更深入的研究銀屑病的發病機制，為臨床治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數據

從基因表達數據庫（Gene expression omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載編號為GSE6710，平 臺 為GPL96［（HG-U133A）Affymetrix Human Genome U133A Array］的芯片數據集和注釋文件。該研究包含26 個樣品，來自于13 位尋常型銀屑病患者的皮損和非皮損活檢樣本。

1.2 GSEA 分析

從GSEA 官網（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）下 載GSEA（GSEA_4.0.3）軟 件 及c5.all.v7.0.symbol.gmt 和c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 文件，使用GSEA 軟件對芯片數據矩陣分別進行1 000 次模擬分析，獲取GO 和KEGG 富集分析結果。

1.3 免疫細胞浸潤矩陣

對來自GEO 數據的芯片數據進行分組，使用R軟件“Bioconductor-limma”包進行數據矯正。從CIBERSOFT 官 網（https：//cibersort. stanford.edu/）下載22 種免疫細胞基因表達矩陣及R 包，使用R 軟 件（https：//www. r-project. org/ R_3.6.3）“e1071”包獲取免疫細胞浸潤矩陣。運用Perl 腳本，篩選P＜0.05 的可信樣本，獲得新的過濾后的免疫細胞浸潤矩陣。

1.4 樣本聚類評價

使用R 軟件進行主成分分析，對過濾后的免疫細胞浸潤矩陣數據進行降維處理，并通過R 軟件“ggplot2”包獲取主成分分析圖像。

1.5 免疫細胞浸潤評估

使用R 軟件繪制柱狀圖、熱圖、共表達熱圖、小提琴圖、成對差異圖，用以分析免疫細胞浸潤分布差異及其相關性。

2 結果

2.1 GSEA 分析

在GO 富集分析中，共2 616 個基因集在銀屑病皮損中上調，其中526 個基因集FDR＜25%，558 個基因集P值＜0.05，見圖1A。主要富集于核分裂的調 節（regulation of unclear division）、染 色 體 分 離（chromosome segregation）等細胞增殖相關過程和細胞質模式識別受體信號通路（cytoplasmic pattern recognition receptor signaling pathway）、天然免疫反應的激活（activation of innate immune response）等免疫相關過程。表1 展示了在銀屑病皮損中上調的歸一化富集分數（Normalized Enrichment Score，NES）排名前20 的基因集。

表1 GO 富集分析NES 前20 的基因集Tab 1 GO enrichment analysis of the top 20 gene sets of NES

在KEGG 富集中，共95 條通路在銀屑病皮損中上調，其中20 條通路FDR＜25%，21 條通路P值＜0.05，見圖1B。主要富集于細胞周期（cell cycle）、亞油酸代謝（Linoleic acid metabolism）、嘧啶代謝（Pyrimidine metabolism）等細胞增殖相關過程和Nod 樣受體信號通路（Nod like receptor signaling pathway）、RIG-Ⅰ樣受體信號通路（RIG-Ⅰlike receptor signaling pathway）、Toll 樣受體信號通路（Toll like receptor signaling pathway）等免疫相關過程以及P53 信 號 通 路（P53 signaling pathway）、膀 胱 癌（Bladder cancer）等癌癥相關通路。表2 展示了在銀屑病皮損中上調的NES 排名前20 的通路。

表2 KEGG 富集分析NES 前20 的基因集Tab 2 KEGG enrichment analysis of the top 20 gene sets of NES

圖1 銀屑病基因表達矩陣的GSEAFig 1 GSEA of gene expression matrix of scurf disease

2.2 免疫細胞浸潤分析

經Perl 腳本P＜0.05 的篩選后，獲得包含26 個可信樣本的免疫細胞浸潤矩陣。對22 種免疫細胞的浸潤矩陣的主成分分析顯示銀屑病皮損樣本和非皮損樣本組間差異明顯，樣本來源可靠，能夠區分銀屑病皮損組和非皮損組，見圖2。

圖2 二維PCA 聚類圖Fig 2 Two dimensional PCA clustering diagram

2.3 免疫細胞浸潤分布及組間差異分析

圖3A、B 的熱圖、柱狀圖顯示了22 種免疫細胞在不同樣本中浸潤分布差異，前13 組為銀屑病非皮損組樣本，后13 組為銀屑病皮損組樣本。圖3C 為22 種免疫細胞的組間浸潤差異小提琴圖，藍色為非皮損組，紅色為銀屑病皮損組。如圖3C 所示22 種免疫細胞中組間浸潤顯著（P＜0.05）的有5 種。其中活化的記憶T 細胞（T cells CD4 memory activated，TM）、濾泡輔助性T 細胞（T cells follicular helper，Tfh）、M0 巨噬細胞、活化的樹突狀細胞在銀屑病皮損組中上調，未活化的肥大細胞在銀屑病皮損組中下調。圖3D 為以上5 種組間浸潤差異顯著的免疫細胞在來源于同一個體的樣本中的成對差異分析圖。

圖3 銀屑病皮損組與非皮損組免疫細胞浸潤差異Fig 3 The difference of immune cell infiltration between lesional and non lesional psoriasis

2.4 免疫細胞相關性分析

活化的樹突狀細胞與Tfh 呈正相關（r=0.59），活化的肥大細胞與M0 巨噬細胞呈正相關（r=0.67）。未活化的肥大細胞和活化的記憶T 細胞TM 呈負相關（r=-0.64），M1 巨噬細胞與調節性T細 胞（T cells regulatory，Treg）呈 負 相 關（r= -0.63），M0 巨噬細胞和未活化的肥大細胞呈負相關（r=-0.58）。見圖4。

圖4 免疫細胞相關性分析Fig 4 Correlation analysis of immune cells

3 討論

在GO 富集分析中，核分裂、染色體分離等與細胞有絲分裂功能相關的基因集在銀屑病皮損中顯著上調，細胞增殖活躍。在KEGG 富集分析中，涉及DNA 復制、核苷酸代謝、蛋白質代謝、脂質代謝的信號通路在銀屑病皮損中顯著上調，為細胞增殖提供了能量供應和物質儲備。角質細胞的過度增殖是銀屑病的基本病理特征之一。在現有的發病機制的模型中，角質細胞在疾病觸發早期和疾病慢性期方面起著至關重要的作用，當皮膚環境改變時，受損的角質細胞釋放的抗菌肽與自身遺傳物質結合形成復合物，進而激活樹突狀細胞開啟適應性免疫，放大了局部免疫反應，在這種炎癥環境中，IL17、TNF-α、IFN-γ 等細胞因子又激活了角質細胞的增殖［4］。角質細胞的增殖在銀屑病中的意義并不僅限于此，有研究發現，銀屑病角質細胞中47.3%的上調基因與細胞因子的誘導信號無重疊，這表明銀屑病表皮可能存在不依賴于炎性細胞因子環境的內在變化［5］。因此，抑制角質細胞的過度增殖，減少細胞增殖所必需的能量供應和物質儲備，或許可以成為銀屑病治療的一種新思路。Zhang 等［6］通過刪除小鼠模型中角質細胞中的葡萄糖轉運蛋白1，顯著抑制了小鼠模型的皮膚增厚和炎癥反應。這種通過抑制細胞代謝從而抑制細胞增殖的方法在腫瘤的研究中應用頗多，主要集中于PI3K-AKT 信號通路。銀屑病與腫瘤存在著細胞過度增殖的相似性，且抑制細胞的能量供應亦能有效減輕銀屑病皮膚增殖和炎癥反應，對于銀屑病角質細胞增殖與細胞代謝的研究，應該進行更加深入的研究。

Nod 樣受體、RIG-Ⅰ樣受體、Toll 樣受體均為模式識別受體，在先天免疫中起著識別病原體和內源性細胞應激信號的作用，從而激活NF-κB、MAPK等信號通路，促進炎癥細胞因子的轉錄，進而介導免疫反應［7，8］。因此這些模式識別受體信號通路的的負調控對于銀屑病的治療具有重要意義。眾所周知，P53 是一種抑癌基因，具有誘導細胞凋亡的作用，本研究顯示，P53 在銀屑病皮損組上調，結果與大多數研究相一致［9-11］。P53 在銀屑病皮膚中的表達可能是角質形成細胞過度增殖所誘導的野生型蛋白，是一種對抗過度增殖的保護機制，只不過這種保護機制可能不足以減弱過度增殖狀態［12］。除誘導凋亡外，P53 也具有抗凋亡的功能，P53 可以靶向促生存的Bcl-2基因的miR-34，因此P53 信號不應被視為單純的誘導凋亡［13］。

本研究得到的Tfh、Th 和活化的樹突狀細胞在銀屑病皮損中上調，活化的樹突狀細胞與Th 呈正相關的結果與現有銀屑病發病模型基本符合，即抗原激活樹突狀細胞后，樹突狀細胞對其進行處理提呈，激活Th，分泌炎性細胞因子維持炎癥環境，而這種炎癥環境又促進了TM 的增殖［14，15］。然而關于巨噬細胞和肥大細胞，仍需進一步討論。在本研究中，M0 巨噬細胞在銀屑病皮損組上調，M1 巨噬細胞與Treg 呈負相關。巨噬細胞分為M0、M1、M2 三種表型，M0 巨噬細胞為未經激活的幼稚的巨噬細胞，M0 巨噬細胞收到M1 或M2 特異性信號則會被激活為M1 巨噬細胞或M2 巨噬細胞［16］。一般來說，M1 巨噬細胞的作用是介導炎癥和細胞/組織損傷，M2 巨噬細胞則調節銀屑病的抗炎和修復［17］。

本研究結果顯示，未活化的肥大細胞在銀屑病皮損組下調，而活化的肥大細胞卻未在皮損組上調。肥大細胞在許多皮膚病中是瘙癢的介導物，有研究表明，P 物質在銀屑病斑塊中表達增加，而P 物質在精神緊張的情況下可以導致肥大細胞脫顆粒，進而出現瘙癢［18，19］。正常皮膚中不會出現皮膚瘙癢，因而肥大細胞的活化程度較低，而在銀屑病皮損中，有部分患者會出現皮膚瘙癢，但并不具有普遍性，這可能是未活化的肥大細胞在銀屑病皮損組下調，而活化的肥大細胞卻未在皮損組上調的原因。

本研究利用生物信息學技術對銀屑病的表達譜芯片進行了GSEA 及免疫細胞浸潤分析，得到了細胞增殖、免疫及癌癥相關通路在銀屑病中起到重要作用；免疫細胞浸潤與目前銀屑病發病模型大體符合，巨噬細胞和肥大細胞在銀屑病中也起著一定程度的作用的結論。本研究進一步揭示了細胞增殖與免疫細胞在銀屑病發病中的重要作用，為銀屑病的臨床治療及藥物研究提供新的思路。但本研究是根據GEO 數據庫中現有的研究數據進行的預測，其中可能會有假陽性或假陰性結論，研究結果尚待進一步實驗驗證。

作者貢獻度說明：

李建紅：提供本文思路；李萍：提供本文指導；周揚：撰寫論文；周揚、韓露、方如男：共同完成論文相關數據資料的獲取和處理；趙艷、郭楊、翟燁：協助完成數據分析和討論。