脂氧素受體激動劑BML-111 對創傷性腦損傷大鼠NLRP3 炎癥小體的影響

胡 煒，王 剛，王 沛，金海濤，劉建敏，呂建萌，黨星波

（陜西省人民醫院 急診外科，陜西 西安 710000）

創傷性腦損傷（traumatic brian injury，TBI）是神經外科常見的創傷性疾病，占所有創傷死亡人數的60%［1］。TBI 可引起炎性巨噬細胞趨化及炎性因子的釋放，繼而導致神經元細胞死亡和神經功能缺陷［2，3］。而NLRP3 炎癥小體是調節神經炎癥反應的重要多蛋白復合物［4-6］。已有研究證實，NLRP3 炎癥小體可通過調節炎癥反應在TBI［7，8］、缺血性腦中風［9，10］、阿爾茨海默?。?1］等中樞神經系統疾病中發揮作用。

BML-111 是一種被證明有效的脂氧素受體激動劑［12］。研究發現，BML-111 可通過激活脂氧素受體產生抗炎作用［12］，因此對缺血性腦中風［13］中的炎癥反應具有抑制作用。但是，BML-111 可否抑制TBI 后NLRP3 炎癥小體功能尚不清楚。因此，本研究擬探討脂氧素受體激動劑BML-111 對大鼠TBI后NLRP3 炎癥小體的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康清潔級雄性SD大鼠60只，體重280～340 g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，于22～24 ℃的溫房中飼養，自由進食水。本研究所有方案和操作手段已獲得陜西省人民醫院倫理委員會的批準。將其隨機分為4 組，包括假手術組（Sham組）、創傷性腦損傷組（TBI 組）、脂氧素受體激動劑BML-111 給藥組（BML-111 組）、脂氧素受體拮抗劑BOC-2 給藥組（BOC-2 組），每組各15 只。采用顱腦撞擊法建立TBI 模型［14］。用氯胺酮120 mg/kg 和甲苯噻嗪6 mg/kg 麻醉大鼠，將其俯臥位固定在立體定位儀上，于右側顱骨冠狀縫后尾側2.3 mm、矢狀縫旁開2.3 mm 處開一直徑5 mm 的骨窗。骨窗處硬腦膜上放一與骨窗大小吻合的墊片及直徑4 mm 的撞針，將20 g 重物從硬腦膜上方15 cm 處通過導管以自由落體撞擊撞針，造成大鼠右側大腦半球腦挫裂傷；Sham 組僅開骨窗但不給予撞擊。TBI組、BML-111 組和BOC-2 組大鼠建立TBI 模型；術前30 min，BOC-2 組 腹 腔 注 射50 μg/kg 的BOC-2［15，16］（溶 于0.2 mL 生 理 鹽 水），Sham 組、TBI 組 和BML-111 組腹腔注射0.2 mL 生理鹽水；腦創傷后即刻和腦創傷后24 h，BML-111 組和BOC-2 組腹腔注 射1 mg/kg 的BML-111［13］（溶 于0.2 mL 生 理 鹽水），Sham 組和TBI 組腹腔注射0.2 mL 生理鹽水。

1.2 主要試劑

BML-111 購自美國Sigma 公司，NLRP3 抗體購自美國Abcam 公司，活化Caspase-3 和總Caspase-3抗體購自美國Cell Signaling 公司，β-actin 和Caspase-1-p20 抗 體 購 自 美 國Santa Cruz 公 司，IL-1β 和IL-18 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，TUNEL 凋亡檢測試劑盒購自美國Roche 公司，BOC-2 購自Phoenix Pharmaceuticals 公司。

1.3 觀察指標

1.3.1 神經功能評分 腦創傷后3 d 和7 d 行腦創傷后神經損傷評分（neurological severity score，NSS）［2］，其中包括反射實驗、警覺性實驗、協調性實驗和運動能力實驗，最大為18 分，分數越高說明顱腦損傷越重。

1.3.2 Western blot 檢測及ELISA 檢測 腦創傷后3 d 和7 d，各組取5 只大鼠，腹腔注射致死劑量的戊巴比妥鈉（80 mg/kg）處死，快速解剖并分離右側腦皮質損傷中心周圍5 mm 區域。加入RIPA 裂解液充分勻漿，將其等分為兩份：一份用蛋白提取試劑盒提取蛋白檢測NLRP3、Caspase-1-p20、活化Caspase-3 的蛋白表達，一份用ELISA 試劑盒檢測IL-1β 和IL-18 的蛋白含量（ng/L）。用于Western blot檢測蛋白樣本變性后，聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉至0.45 μm 孔徑的PVDF 膜上。5%的脫脂牛奶中室溫封閉后，加入一抗（NLRP3 抗體，1∶1 000；Caspase-1-p20 抗體，1∶400；活化Caspase-3 抗體，1∶400；β-actin抗體，1∶500；總Caspase-3抗體，1∶1 000）4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的生物二抗室溫反應2 h，后行ECL 顯影并拍照。用Quantity One 軟件行圖像分析。NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白水平以目標蛋白灰度值/β-actin 灰度值表示，活化Caspase-3 蛋白水平以目標蛋白灰度值/總Caspase-3 灰度值表示。

1.3.3 TUNEL法凋亡檢測 腦創傷后3 d和7 d，各組取5 只大鼠，腹腔注射致死劑量的戊巴比妥鈉（80 mg/kg）處死，并用4 ℃4%多聚甲醛心內灌注。將包含挫傷區域（Sham 組選取骨窗周圍區域）的冠狀切塊包埋在石蠟中，做5 μm 的連續切片。用0.1%Triton X-100 透化2 min，封閉30 min 后，根據廠商的說明書使用行TUNEL 染色，并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）行核復染。熒光顯微鏡400×倍鏡下觀察損傷側大腦皮層并攝片，DAPI 染色細胞核呈藍色熒光，TUNEL 陽性細胞核呈綠色熒光。

1.4 統計學處理

應用SPSS 13.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。組間及組內比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠腦創傷后腦含水率和NSS評分的比較

與Sham 組 比 較，TBI 組 腦 含 水 率 及NSS 評 分在腦創傷后3 d 和7 d 均明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與TBI 組比較，BML-111 組腦含水率及NSS 評分在腦創傷后3 d 和7 d 均顯著減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與BML-111 組比較，BOC-2組腦含水率及NSS評分在腦創傷后3 d和7 d 均明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠腦創傷后腦含水率和NSS評分的比較（n=5，±s）Tab 1 Comparison of brain water content and NSS scores of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

表1 4組大鼠腦創傷后腦含水率和NSS評分的比較（n=5，±s）Tab 1 Comparison of brain water content and NSS scores of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

注：NSS：神經損傷評分；Sham 組：假手術組；TBI 組：創傷性腦損傷組；BML-111 組：BML-111 給藥組；BOC-2 組：脂氧素受體拮抗劑BOC-2 給藥組；與Sham 組比較，aP＜0.05；與TBI 組比較，bP＜0.05；與BML-111 組比較，cP＜0.05。

組別含水率（%）NSS 評分3 d 0 11.8±0.9a 9.3±0.5ab 11.9±1.1ac 288.2＜0.001 7 d 0 8.5±1.2a 5.4±0.3ab 9.7±1.0ac 149.9＜0.001 Sham 組TBI 組BML-111 組BOC-2 組F P 71.885±2.420 87.117±3.151a 79.199±5.520ab 85.446±2.246ac 18.65＜0.001

2.2 4 組大鼠腦創傷后不同時間點腦皮層NLRP3和Caspase-1-p20 蛋白表達的比較

與Sham 組比較，腦創傷后3 d 和7 d，TBI 組腦皮層NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白表達均明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與TBI 組比較，腦創傷后3 d 和7 d，BML-111 組腦皮層NLRP3和Caspase-1-p20 蛋白表達均顯著減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與BML-111 組比較，腦創傷后3 d 和7 d，BOC-2 組 腦 皮 層NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白表達均明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2 和圖1。

圖1 4 組大鼠腦創傷后不同時間點腦NLRP3、Caspase-1-p20、活化Caspase-3 蛋白表達的比較Fig 1 Comparison of the protein expression of NLRP3，Caspase-1-p20，and activated Caspase-3 in the brain of the four groups at different time points after brain trauma

表2 4 組大鼠腦創傷后不同時間點腦皮層NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白表達的比較（n=5，±s）Tab 2 Comparison of the protein expression of NLRP3 and Caspase-1-p20 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

表2 4 組大鼠腦創傷后不同時間點腦皮層NLRP3 和Caspase-1-p20 蛋白表達的比較（n=5，±s）Tab 2 Comparison of the protein expression of NLRP3 and Caspase-1-p20 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

注：Sham 組：假手術組；TBI 組：創傷性腦損傷組；BML-111 組：BML-111 給藥組；BOC-2 組：脂氧素受體拮抗劑BOC-2 給藥組。與Sham 組比較，aP＜0.05；與TBI 組比較，bP＜0.05；與BML-111 組比較，cP＜0.05。

組別Sham 組TBI 組BML-111 組BOC-2 組NLRP3 7 d 0.282±0.035 0.693±0.044a 0.382±0.045ab 0.634±0.097ac 63.29＜0.001 Caspase-1-p20 3 d 0.149±0.010 0.459±0.081a 0.259±0.023ab 0.405±0.071ac 38.73＜0.001 7 d 0.168±0.021 0.484±0.076a 0.218±0.027ab 0.455±0.052ac 64.65＜0.001 FP 3 d 0.296±0.044 0.664±0.088a 0.434±0.043ab 0.616±0.088ac 36.12＜0.001

2.3 4 組大鼠腦創傷后不同時間點腦IL-1β 和IL-18蛋白含量的比較

與Sham 組比較，腦創傷后3 d 和7 d，TBI 組腦皮層IL-1β 和IL-18 蛋白含量均明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與TBI 組比較，腦創傷后3 d和7 d，BML-111 組 腦 皮 層IL-1β 和IL-18 蛋 白 含 量均顯著減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與BML-111 組比 較，腦創傷后3 d 和7 d，BOC-2 組腦皮層IL-1β 和IL-18 蛋白含量均明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4 組大鼠腦創傷后不同時間點腦皮層IL-1β 和IL-18 蛋白含量的比較（ng/mL，n=5，±s）Tab 3 Comparison of the content of IL-1β and IL-18 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

表3 4 組大鼠腦創傷后不同時間點腦皮層IL-1β 和IL-18 蛋白含量的比較（ng/mL，n=5，±s）Tab 3 Comparison of the content of IL-1β and IL-18 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

注：Sham 組：假手術組；TBI 組：創傷性腦損傷組；BML-111 組：BML-111 給藥組；BOC-2 組：脂氧素受體拮抗劑BOC-2 給藥組；與Sham 組比較，aP＜0.05；與TBI 組比較，bP＜0.05；與BML-111 組比較，cP＜0.05。

組別IL-1β IL-18 7 d 33.0±5.2 84.9±9.8a 43.4±7.5ab 82.4±9.1ac 65.01＜0.001 Sham 組TBI 組BML-111 組BOC-2 組F P 3 d 50.0±3.2 119.6±17.5a 71.4±10.9ab 110.5±13.6ac 41.76＜0.001 7 d 54.9±6.5 137.6±20.1a 75.0±10.6ab 141.1±18.5ac 51.08＜0.001 3 d 27.6±6.2 86.8±8.1a 43.8±7.3ab 81.5±15.7ac 49.43＜0.001

2.4 4 組大鼠腦創傷后不同時間點腦皮層TUNEL陽性細胞數和活化Caspase-3 蛋白表達的比較

與Sham 組比較，腦創傷后3 d 和7 d，TBI 組腦皮層TUNEL 陽性細胞數和活化Caspase-3 蛋白表達均明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與TBI 組 比 較，腦 創 傷 后3 d 和7 d，BML-111 組 腦 皮層TUNEL 陽性細胞數和活化Caspase-3 蛋白表達均顯著減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與BML-111 組比 較，腦創傷后3 d 和7 d，BOC-2 組腦皮層TUNEL 陽性細胞數和活化Caspase-3 蛋白表達均明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表4 和圖1、2。

表4 4 組大鼠腦創傷后不同時間點腦皮層TUNEL 陽性細胞數和活化Caspase-3 蛋白表達的比較（n=5，±s）Tab 4 Comparison of the number of TUNEL-positive cells and the protein expression of active Caspase-3 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

表4 4 組大鼠腦創傷后不同時間點腦皮層TUNEL 陽性細胞數和活化Caspase-3 蛋白表達的比較（n=5，±s）Tab 4 Comparison of the number of TUNEL-positive cells and the protein expression of active Caspase-3 in the brain of the four groups at different time after brain trauma（n=5，±s）

注：Sham 組：假手術組；TBI 組：創傷性腦損傷組；BML-111 組：BML-111 給藥組；BOC-2 組：脂氧素受體拮抗劑BOC-2 給藥組；與Sham 組比較，aP＜0.05；與TBI 組比較，bP＜0.05；與BML-111 組比較，cP＜0.05。

組別TUNEL 陽性細胞（/mm2）3 d 58±21 563±77a 318±43ab 620±80ac 91.06＜0.001 7 d 79±28 653±98a 324±26ab 700±124ac 69.77＜0.001活化Caspase-3 3 d 0.124±0.015 0.623±0.053a 0.232±0.024ab 0.503±0.085abc 99.60＜0.001 7 d 0.114±0.021 0.608±0.121a 0.318±0.058ab 0.627±0.067ac 52.83＜0.001 Sham 組TBI 組BML-111 組BOC-2 組FP

圖2 4 組大鼠腦創傷后不同時間點腦TUNEL 陽性凋亡細胞數的比較Fig 2 Comparison of the number of TUNEL-positive cells in the brain of the four groups at different time after brain trauma

3 討論

TBI 是由機械性腦組織損傷（原發性損傷）和繼發性損傷導致的［1，17］。原發性損傷一旦發生就具有不可逆性，尚缺乏有效的治療手段。而繼發性損傷具有延遲性，被認為是由多種因素共同引起的，其中包括炎癥反應惡化及隨后的神經元細胞凋亡［2，18］。因此，抑制神經炎癥反應可能是治療或緩解TBI 的有效手段。

脂氧素是花生四烯酸在脂氧合酶作用下生成的抗炎分子［13］。脂氧素可與其特異性受體（FPR2）結合，起到限制中性粒細胞募集、增加抗炎因子生成及促進炎性碎片清除的作用［13，19］。該受體可在中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、小膠質細胞等多種炎癥相關細胞中表達［19-21］。已有研究［13］顯示，靜脈注射1 mg/kg 的脂氧素受體激動劑BML-111 可緩解大鼠缺血再灌注損傷所致的炎癥反應。因此，參照該文獻，本研究于TBI 后即刻和24 h 腹腔注射1 mg/kg 的BML-111。結果顯示，該BML-111 治療可顯著減少大鼠腦含水率，降低腦創傷后3 d和7 d 的NSS 評分。此外，本研究結果還顯示，BML-111 治療可減輕TBI 后腦皮層TUNEL 陽性細胞數和凋亡標記物Caspase-3 的表達。這些結果都說明BML-111 治療可緩解急性腦創傷所致的腦水腫、神經功能損傷及細胞凋亡。

NLRP3 炎癥小體是目前研究最多的炎癥小體［4］。當細胞暴露于外源性或內源性病原分子時，NLRP3 將發生激活，促使Caspase-1 前體自動切割成Caspase-1 活性片段（Caspase-1-p20）［22］?；罨腃aspase-1 可 促 使 活 性IL-1β 和IL-18 分 子 生 成 并 釋放。IL-1β 和IL-18 的產生會進一步與其它促炎因子（如TNF-α）產生協調作用，加劇腦外傷后的繼發性損傷。因此，本研究檢測了TBI 后大鼠腦NLRP3、Caspase-1-p20（NLRP3 炎癥小體激活標記物）及NLRP3 炎癥小體激活產物（IL-1β 和IL-18）的蛋白表達。結果顯示，BML-111 治療可抑制TBI 后腦皮層NLRP3、Caspase-1-p20、IL-1β 和IL-18 的生成，說明BML-111 治療具有抗NLRP3 炎癥小體生成的作用。為了進一步驗證脂氧素受體于這種作用的相 關性，于TBI 前30 min 給予大鼠50 μg/kg 的脂氧素 受 體 拮 抗 劑BOC-2［15，16］。結 果 發 現，BOC-2 可 逆轉BML-111 的抗NLRP3 炎癥小體生成作用。這就提示，BML-111 的抗NLRP3 炎癥小體生成作用主要是通過激活脂氧素受體所產生的。

綜上所述，本研究證實了BML-111 可通過抑制NLRP3 炎癥小體激活以緩解大鼠TBI 繼發性腦損傷，預示了激活脂氧素受體可能是臨床上治療TBI的新策略和新思路。

作者貢獻度說明：

胡煒：文章撰寫和動物模型構建；王剛：ELISA 實驗；王沛：免疫熒光實驗；金海濤：Western blot 實驗；劉建敏：動物飼養；呂建萌：實驗設計及材料收集；黨星波：實驗設計及文章校稿。