右美托咪定抗缺血性心律失常作用及機制研究

郭悅平，劉 艷，劉 穎，于佳岐，王 超，周 楊，張海瑩

（1. 海南醫學院附屬第一醫院麻醉科，海南海口 570102；2. 海南醫學院藥學院、海南醫學院熱帶轉化醫學教育部重點實驗室，海南 海口 571199；3. 海南醫學院第一臨床學院，海南 海口 571199；4. 三亞中心醫院，海南 三亞 572000；5. 哈爾濱醫科大學藥理教研室，黑龍江 哈爾濱 150081）

心律失常是心血管系統最常見的病癥之一，同時也是心源性猝死的主要誘因。心血管疾病是全球第一大死亡原因［1，2］。據估計，到2030 年，每年將有2 360 萬人死于心血管疾病［3］。各種原因導致的心肌缺血是圍術期心律失常的重要誘因，其特點是發生率高，治療難度大。除少部分心律失常首選電復律外，目前認為藥物治療仍是主要療法。但由于許多藥物缺乏注射劑型、起效緩慢、與麻醉藥物相互作用、降低心肌收縮力、降低血壓等問題，不適合圍術期或術中使用。臨床上仍然迫切需要適合圍術期場景下使用的抗心律失常藥物。

α2腎上腺素受體（α2-adrenergic receptor，α2-AR）為G 蛋白偶聯受體超家族之一，在人類及其他哺乳動物體內均有表達。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一種高選擇性α2腎上腺素受體激動劑，它作為中樞性鎮靜鎮痛藥被引入臨床，主要用于圍手術期鎮靜，鎮痛，穩定血流動力學等［4-6］。然而，一些臨床觀察性研究發現，使用右美托咪定影響圍術期心律失常的發生［7］。例如，在成人心臟手術圍術期使用右美托咪定可以顯著減少房顫及室性心動過速的發生率［8］。在兒童法洛四聯征和完全性大動脈轉位患者中右美托咪定可減少術后房顫發生［9］。而在另一項研究中，室間隔缺損修補術患者中給予右美托咪定可以減少交界性異位心動過速的發生［10，11］。我 們 在 臨 床 實 踐 中 發 現，α2受 體 激 動 劑 對某些類型的快速性心律失常具有治療作用［12］。但是目前缺乏對α2受體激動劑用于治療心律失常的機制研究，只有闡明其作用機制，才能明確適應證和禁忌證，在提高療效的同時減少副作用的發生，安全用于圍術期患者。因此，本研究采用體外分子生物學實驗，旨在探究右美托咪定的抗心律失常作用及機制，以期為急性心肌梗死病程中缺血和再灌注心律失常的防治提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠，體質量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物飼養在標準動物室條件下，溫度為（23±1）°C，濕度為（55±5）%，給予適量的食物和水，通風良好。本課題動物的使用及實驗過程均依照美國國立衛生研究院善待動物的實驗準則，并得到海南醫學院倫理委員會的批準。

1.2 實驗材料及儀器

實驗主要藥物包括右美托咪定（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司），育亨賓（上海源葉生物科技有限公司），TTC 染色液（北京索萊寶科技有限公司）。主要儀器有小動物心電檢測系統（美國Iworx 公司）；小動物呼吸機（上海玉研科學儀器有限公司）；可拍照光學顯微鏡（Olympus 公司）；全細胞膜片鉗（美國Axon 公司）；電極控制儀（日本Narishige 公司）。

1.3 實驗分組及給藥

將50 只大鼠采用數字隨機法分為假手術組（Ctl 組）、心律失常模型組（Model 組）、心律失常+右美托咪定組（Dex 組）、心律失常+育亨賓+右美托咪定組（Yoh + Dex 組）、心律失常+育亨賓組（Yoh 組），每組10 只。（1）假手術組：記錄10 min 正常心電后，只穿線不結扎；（2）模型組：記錄10 min正常心電后，結扎左冠狀動脈前降支，持續記錄心電2 h；（3）右美托咪定組：記錄正常心電7 min 后，大鼠尾靜脈注射右美托咪定（2.3 ng/mL），觀察3 min后進行結扎；（4）育亨賓+右美托咪定組：記錄正常心電，在給予右美托咪定的前2 min 給予育亨賓，其后操作同模型組；（5）育亨賓組：記錄正常心電5 min，大鼠尾靜脈注射育亨賓（7.8 mg/mL），5 min 后進行結扎，方法同模型組。

1.4 大鼠缺血性心律失常模型的建立

雄性Wistar 大鼠，戊巴比妥鈉溶液（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術臺上，接入生物機能實驗系統，連續記錄標準Ⅱ導聯心電圖。剔除小鼠胸前毛發，充分消毒后頸部正中開口，分離右側頸總動脈，動脈插管后鏈接壓力換能器，記錄動脈血壓，氣管插管。開胸后接小動物人工呼吸機（潮氣量6～10 mL，呼吸比1∶2，呼吸頻率60 次/min），剪開心包膜，尋找左冠狀動脈前降支，在其下穿線，待呼吸、血壓平穩15 min 后，結扎左前降支，使其缺血30 min，以心電圖ST 段抬高為結扎成功標志。實驗結束后，迅速開胸，取下心臟，洗凈并做簡單修剪，立即進行檢測，其余立即放入液氮中速凍，于-80 ℃冰箱中保存。

1.5 心電圖記錄

利用BL-420E 系統記錄并分析心電圖，統計心律失常出現時間，累積發生時間，室性期前收縮持續時間，房室傳導阻滯出現及持續時間。根據心電圖數據進行心律失常評分，統計給藥前后RR 間期，PR 間期，QRS 間期以及QT 間期。計算校正QT 間期（QTc），公式QTc=QT/（RR/100）1/2。

1.6 心律失常評分方法

采用Curtis 和Walker 心率失常評分法：無心率失常0 分，偶發室性早搏1 分，頻發室性早搏2 分，室性心動過速（1～2 次）3 分，室性心動過速（≥3 次）4分，室顫或死亡5 分。

1.7 TTC 染色測量心肌梗死面積

取大鼠心臟組織，放于-20 ℃冰箱中速凍20 min，然后切成2 mm 薄片。將切片置于1%的TTC溶液中，放于37 ℃烘箱15～30 min，避光，取出已染色的切片放于4%多聚甲醛溶液中固定12 h 后，拍照，觀察染色結果，非梗死心肌組織為紅色，缺血壞死心肌組織為蒼白色。應用Image 軟件分析測量缺血面積，計算缺血面積占心室面積百分比。

1.8 成鼠心肌細胞急性分離

成鼠經腹腔麻醉15 min 后，打開胸腔，迅速取出大鼠心臟，置于含鈣的4 ℃臺式液中，主動脈插入導管并與Langendorff 灌流裝置連接，該過程注意防止灌流裝置和導管連接處進氣泡，灌流裝置保持恒溫37 ℃。心臟經無鈣臺式液灌流，待灌流速度穩定后，向灌流液中加入含有Ⅱ型膠原酶（1 mg/mL）和牛血清蛋白（BSA，0.75 mg/mL）的無鈣臺式液。隨著灌流進行，在膠原酶作用下，心臟組織逐漸變軟，失去彈性，待灌流液滴速出現明顯增快現象時，取下心臟，停止灌流，將心臟左室置于含有CaCl2（200 μmol/L）和BSA（1%）的有鈣臺式液中，輕輕剪碎心臟組織成小塊，100 目濾網過濾，濾液中的細胞即為分離得到的心肌細胞，顯微鏡下呈長桿狀或矩形，條紋清晰，棱角分明，少部分細胞可自發性收縮。

1.9 全細胞膜片鉗實驗

首先，采用兩步法拉制電極，使得拉制后，電極入液阻值在2～3 MΩ。實驗開始前將灌注有電極內液的電極安裝在夾持器上，并在浴槽中加入測鈣外液。使得整個膜片鉗系統預熱0.5 h，減少電極漂移。打開Multiclamp 700B 控制面板和記錄軟件，將急性分離的大鼠心肌細胞轉移至倒置顯微鏡（IX-70，Olympus）操作臺上的浴槽內。實驗前給予900 pA，10 ms，1 Hz 的刺激5 min，選擇靜息電位小于-70 mV 的細胞進行試驗，記錄穩定后各組心肌細胞的動作電位。

1.10 統計學處理

所有數據兩組間比較應用非配對t檢驗，多組間差異比較應用單因素方差分析（ANOVA）的方法進行統計學分析。使用Graphpad Prism 7.0 軟件進行數據分析及圖表制作，所有數據以（xˉ±s）形式表示，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 建立大鼠缺血性心律失常模型

采取結扎左冠脈前降支的方法建立大鼠室性心律失常模型，大鼠正常竇性心律（圖1A），左冠脈結扎后可見心電圖ST 段明顯升高出現二聯律（圖1B），然后逐漸加重，出現多源性室早、短陣性室速，繼而發展為持續性室性心動過速（圖1C），甚至室顫（圖1D）。證明缺血性心律失常模型建立成功。

圖1 各型心律失常心電圖Fig 1 Arrhythmia results

2.2 篩選藥物濃度

建立大鼠缺血性心律失常模型前給予Dex-10（2.3 ng/mL）、Dex-5（1.25 ng/mL）、Dex-1（0.23 ng/mL）3 種不同濃度的右美托咪定。對于心律失常的嚴重程度進行評分，如表1 所示，Dex-5 和Dex-1 預處理均能顯著降低心律失常評分，其中以Dex-10 組效果最明顯（F=25.87，P＜0.001）；同時給予高濃度的右美托咪定Dex-10 后，能明顯降低房室傳導阻滯（atrioventricular block，AVB）的 持 續 時 間（F=110.54，P＜0.001），且這種作用也呈濃度依賴性。證明右美托咪定降低心律失常評分及房室傳導阻滯具有濃度依賴性，并且Dex-10 對這種改變效果最顯著。

表1 各組心律失常評分和房室傳導阻滯情況（n=6，±s）Tab 1 Arrhythmia score and the occurrence of AVB（n=6，±s）

表1 各組心律失常評分和房室傳導阻滯情況（n=6，±s）Tab 1 Arrhythmia score and the occurrence of AVB（n=6，±s）

注：與Model 組比較，***P＜0.001，與Dex-10 組相比，###P＜0.001。

房室傳導阻滯（ms）134.17±11.36 14.50±2.95***38.50±17.69 62.17±11.37 110.54＜0.001組別Model 組Dex-10 組Dex-5 組Dex-1 組FP心律失常評分（score）5.03±0.72 1.70±0.41***3.55±0.51###3.60±0.61###25.87＜0.001

2.3 激動α2 受體可以降低心律失常評分及死亡率

建立大鼠缺血性心律失常模型前給予右美托咪定Dex-10（2.3 ng/mL），育亨賓于結扎前5 min 尾靜脈注射7.8 mg/mL。對于心律失常的嚴重程度進行 評 分，Dex 組 明 顯 低 于 模 型 組（F=12.98，P＜0.001），給予α2受體阻斷劑育亨賓后評分增加，右美托咪定抗心律失常作用被阻斷；給予右美托咪定后，大鼠的死亡率較模型組降低20%，而育亨賓可以逆轉右美托咪定的保護作用，見表2。證明右美托咪定可以減少室性心律失常的發生，并且這一作用是通過激動α2受體實現的。

表2 各組心律失常評分及大鼠死亡率（±s）Tab 2 Arrhythmia score and morality rate（±s）

表2 各組心律失常評分及大鼠死亡率（±s）Tab 2 Arrhythmia score and morality rate（±s）

注：與Model 組相比，*P＜0.05，***P＜0.001。

組別Model 組Dex-10 組Yoh 組Yoh+Dex 組統計量P大鼠死亡率（%）0.20 0.00*0.25 0.22—＜0.05 n 8 10 6 7心律失常評分（score）5.03±0.72 1.70±0.41***5.02±1.09 4.70±1.33 12.98＜0.001

2.4 激動α2受體減少心肌梗死面積

TTC 染色后，正常心肌組織呈鮮紅色，而梗死的心肌組織呈白色。統計心肌梗死面積，用梗死區（蒼白區）面積/全心面積（磚紅色區+蒼白區）的百分比（IS%）表示。大鼠右美托咪定預處理后，其心肌 梗 死 面 積 明 顯 低 于Model 組（F=13.11，P＜0.05），而Yoh 組逆轉右美托咪定作用，使梗死面積增加，見表3。綜上結果表明，右美托咪定能有效抑制大鼠缺血造成的心肌梗死，具有心肌保護作用。

表3 各組梗死區域面積定量分析（%，n=6，±s）Tab 3 Quantitative analysis of myocardial infarction size in each group（%，n=6，±s）

表3 各組梗死區域面積定量分析（%，n=6，±s）Tab 3 Quantitative analysis of myocardial infarction size in each group（%，n=6，±s）

注：與Model 組相比，**P＜0.01。

梗死面積35.33±2.14 10.87±0.14**29.15±0.34 30.47±7.70 13.11＜0.01組別Model 組Dex-10 組Yoh 組Yoh+Dex 組FP

2.5 激動α2受體縮短QT 間期

對給予右美托咪定前后檢測的心電圖進行分析，通過兩個心室興奮傳播過程的電位變化顯示右美托咪定對于結扎前心臟的QTc、PR、QRS、RR 間期并未產生影響（P＞0.05），見表4。同時右美托咪定對于結扎左前降支后心臟的PR、QRS、RR 間期也并未產生影響（P＞0.05），但是可以縮短結扎后QTc 間期（F=9.41，P＜0.01），見表5。以上結果證明激動α2受體會影響動作電位的復極過程。

表4 手術前心電圖檢測結果（ms，n=6，±s）Tab 4 Preoperative ECG measurements（ms，n=6，±s）

表4 手術前心電圖檢測結果（ms，n=6，±s）Tab 4 Preoperative ECG measurements（ms，n=6，±s）

組別Ctl 組Dex-10 組Yoh 組Yoh+Dex 組FP QTc 50.67±7.94 50.50±6.35 50.33±7.81 54.83±9.06 0.46＞0.05 PR 50.00±3.58 49.33±5.72 46.33±6.14 50.00±3.90 0.75＞0.05 QRS 35.83±7.33 37.33±3.14 38.50±2.66 43.83±7.49 2.29＞0.05 RR 151.17±6.79 160.67±7.79 168.33±6.68 147.83±7.83 2.05＞0.05

表5 手術后心電圖檢測結果（ms，n=6，±s）Tab 5 Postoperative ECG measurements（ms，n=6，±s）

表5 手術后心電圖檢測結果（ms，n=6，±s）Tab 5 Postoperative ECG measurements（ms，n=6，±s）

注：與Ctl 組相比，*P＜0.05，與Model 組相比，##P＜0.01。

RR 151.17±6.79 155.17±14.23 163.83±8.95 178.33±8.14 147.83±7.83 2.29＞0.05組別Ctl 組Model 組Dex-10 組Yoh 組Yoh+Dex 組F P QTc 50.67±7.94 66.67±7.09*47.17±9.28##66.50±10.11 71.17±8.16 9.41＜0.01 PR 50.00±3.58 49.17±5.60 49.17±5.19 50.00±3.90 52.00±8.37 0.27＞0.05 QRS 35.83±7.33 38.33±3.20 38.50±2.66 40.50±6.35 43.50±3.67 3.19＞0.05

2.6 激動α2受體縮短動作電位時程

通過全細胞膜片鉗技術對給予右美托咪定前后動作電位時程（action potential duration，APD）進行檢測，結果顯示，正常組心肌細胞動作電位復極50% 和90% 的 時 間（APD50和APD90）分 別 為（138.00±8.60）ms 和（174.67±11.95）ms，Dex 處理組APD50和APD90分別為（107.66±5.79）ms 和（154.33±11.84）ms，Dex 可以明顯縮短APD50（t=4.136，P＜0.05）與APD90（t=2.83，P＜0.05），見 表6。綜上結果進一步表明，右美托咪定激動心臟α2受體后影響心肌細胞動作電位的復極化過程，進而抑制心律失常的發生。

表6 右美托咪定對大鼠心肌細胞APD 的影響（ms，n=3，±s）Tab 6 Alterations of action potential duration after dex preconditioning（ms，n=3，±s）

表6 右美托咪定對大鼠心肌細胞APD 的影響（ms，n=3，±s）Tab 6 Alterations of action potential duration after dex preconditioning（ms，n=3，±s）

注：與Ctl 組相比，*P＜0.05。

APD90 174.67±11.95 154.33±11.84*2.83＜0.05組別Ctl 組Dex 組t P APD50 138.00±8.60 107.66±5.79*4.136＜0.05

3 討論

右美托咪定通過激活中樞α2受體減少交感神經活動，發揮心血管調節作用。最近有研究表明在心肌組織中也存在A 和C 兩種α2受體亞型。預先給予右美托咪定可以激動心肌α2受體，減少心肌梗死面積，增加冠脈血流量，產生心肌保護作用［13］。個別臨床研究也顯示右美托咪定可通過多種信號通路起到心肌保護作用［14］。臨床實踐中發現，α2受體激動劑對某些類型的快速性心律失常具有預防和治療作用［12，15］。總之，有限的臨床研究中包括不同的患者群及不同臨床場景，療效報道結果不一致，有時甚至有導致心律失常發生的作用。例如，有研究認為右美托咪定并不能降低房顫發生率，甚至可能增加有房顫病史患者再發［16，17］。上述研究中涉及的患者多為心臟外科手術，大都因進行體外循環經歷心肌缺血，但是病種及年齡存在的差異可能產生心肌結構和離子通道表達的區別，即在各自病理情況下心肌已發生某種程度的結構重建和電重建，這也是導致對右美托咪定抗心律失常作用改變的原因，表現為臨床報道療效不一致。所以，闡明右美托咪定治療心律失常的機制，對于判定α2受體激動劑適用于哪些類型心律失常的治療、何種情況下具有致心律失常作用非常關鍵。

本研究觀察到給予大鼠α2受體激動劑右美托咪定后可顯著降低心肌缺血導致的室性心律失常評分及死亡率，而這種作用可被α2受體阻斷劑育亨賓所阻斷。證明激活α2受體具有一定抗心律失常作用。但同時右美托咪定的另一種更為重要的抗心律失常機制也可能存在：直接作用于心肌α2受體，影響到心肌細胞的動作電位過程，進而減少心律失常的發生。

心肌細胞膜離子通道表達或功能異常是形成心律失常最重要的病理生理基礎［18，19］。藥物作用于離子通道可以起到對抗或導致心律失常的作用，離子通道遺傳基因的變異和多態性會影響到藥物對心肌細胞的作用。參與心肌細胞動作電位產生的通道主要有鈉通道，鈣通道，鉀通道等，分別發揮重要作用［20］。心肌復極化過程主要與鈣離子和鉀離子通道有關，一項臨床觀察分析了兒童的12 導聯心電圖，發現給予右美托咪定后心率校正的QTc 間期縮短［21］。據此推測，激動α2受體可能作用于動作電位復極過程，影響參與復極的相關離子通道和電流來產生抗心律失常作用。本研究通過對比大鼠給予右美托咪定前后心電圖顯示，激動α2受體可以縮短QTc 間期，而對P-R、QRS、R-R 間期未產生影響。其次，本研究采用全細胞膜片鉗技術檢測了激動α2受體后動作電位時程的變化，結果顯示APD50與APD90同樣被縮短。表明α2受體影響動作電位復極化過程，進而產生抗心律失常作用。

綜上所述，本研究發現右美托咪定通過激活心臟α2受體，影響動作電位的復極化過程，進而減少缺血性心律失常的發生。該研究結果為α2受體激動劑作為抗心律失常藥物在圍術期合理應用奠定堅實的理論基礎，有助于明確其適應證和禁忌證，提高臨床療效，降低副作用發生率。同時，也為未來此類藥物研發提供了基礎。但目前本研究雖然提出了α2受體是圍術期心律失常治療新靶點，但仍需進一步明確α2受體調控離子通道表達及電流變化的分子機制，以期解析心律失常的發病機制，為制定更好的治療方案提供依據。