基于核磁共振技術(shù)比較厚樸與凹葉厚樸醇提物的化學(xué)成分

★ 韓君 李厚聰 張志鋒 王曉彤 張志強(qiáng)（.北京康仁堂藥業(yè)有限公司中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 北京 00；.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部 湖北 恩施 445000；.西南民族大學(xué)青藏高原研究院 成都 605）

近年來(lái)，隨著健康中國(guó)戰(zhàn)略的實(shí)施，以及《關(guān)于促進(jìn)中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的意見》《中華人民共和國(guó)基本醫(yī)療衛(wèi)生與健康促進(jìn)法》等的施行，國(guó)家鼓勵(lì)培育道地中藥材。道地中藥材厚樸在四川、湖北等地栽培面積不斷擴(kuò)大，但新的問(wèn)題也日趨凸顯。如四川、湖北等地從江浙地區(qū)大量引進(jìn)凹葉厚樸種源，在同一栽種范圍內(nèi)，厚樸和凹葉厚樸同時(shí)存在。目前對(duì)兩種基原的鑒別存在很多困難，如組織形態(tài)學(xué)方面兩種基原相似性極高，準(zhǔn)確鑒別較為困難［1-2］；色譜分析方面主要集中在揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分的特征圖譜研究［3-5］，然而特征圖譜需要大量標(biāo)準(zhǔn)品以及現(xiàn)有研究缺少對(duì)厚樸相關(guān)化合物的多級(jí)質(zhì)譜裂解途徑及其規(guī)律的研究，操作性不強(qiáng)；分子生物學(xué)方面，前期實(shí)驗(yàn)研究采用psbA/trnH 引物和ITS 通用引物對(duì)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增并直接測(cè)序，結(jié)果無(wú)法區(qū)分2 種基原；核磁共振光譜方面，聶映［6］用1H-NMR 技術(shù)測(cè)定了不同產(chǎn)地厚樸樣品的1H-NMR 指紋圖譜，但缺乏對(duì)凹葉厚樸的研究，Yong Jiang 等［7］發(fā)現(xiàn)厚樸變種的1H-NMR 存在差異但不同產(chǎn)地之間無(wú)差異，且僅以厚樸酚與和厚樸酚的差異性進(jìn)行區(qū)分，并未結(jié)合其它譜圖歸屬不同的信號(hào)。

定量核磁碳譜（13C-qNMR）可以彌補(bǔ)1H-NMR共振峰重疊多的缺點(diǎn)，同時(shí)13C-qNMR 共振圖譜和1H-NMR 共振圖譜二者相輔相成，也可以相互印證［8］。核磁共振擴(kuò)散排序譜（DOSY）是研究復(fù)雜混合物體系、歸屬不同分子譜峰強(qiáng)有力的工具［9］，被喻為NMR 的“色譜”技術(shù)，且無(wú)須進(jìn)行實(shí)際分離，譜峰分離而非分子的物理分離，即虛分離，保持了混合物體系中原有的化學(xué)平衡和化學(xué)環(huán)境不被破壞，得到更加客觀的信息［10-11］。本文應(yīng)用NMR（1H-NMR、13C-qNMR 和DOSY）綜合分析厚樸兩種基原的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)信息、成分相對(duì)比例和特征信號(hào)描述，為保證道地產(chǎn)區(qū)厚樸藥材質(zhì)量具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與軟件 Bruker AVANCE 500 Ⅲ型超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司）；TOPSPIN 4.0.8 核磁處理軟件；BSA124S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑 收集了四川、湖北、浙江、福建4 個(gè)省份共10 份厚樸樣本，由西南民族大學(xué)張志鋒教授鑒定為木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalisRehd. et Wils.）和凹葉厚樸（Magnolia officinalisRehd. et Wils. var.bilobaRehd. et Wils.，）詳細(xì)信息見表1，氘代甲醇（美國(guó)CIL 公司）。

表1 不同產(chǎn)地厚樸樣品信息以及厚樸酚與和厚樸酚的HPLC含量測(cè)定 %

1.3 方法

1.3.1 NMR 樣品制備 稱取厚樸和凹葉厚樸樣品60 g 置于圓底燒瓶中加無(wú)水乙醇1 000 mL，加熱回流1 h，提取液于65 ℃減壓濃縮，并于60 ℃減壓干燥箱中烘干，取固體粉末20 mg 至NMR 樣品管中，加入氘代甲醇溶解，用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 NMR 實(shí)驗(yàn)條件1H-NMR 的工作頻率為500.13 MHz，譜寬為50 000.50 Hz。二位DOSY 采用標(biāo)準(zhǔn)脈沖程序LEDBPG2S 采集，采樣溫度為298 K，時(shí)域點(diǎn)數(shù)為4 096，采樣延遲時(shí)間為1.5 s，掃描次數(shù)為8，空掃次數(shù)為4，梯度持續(xù)時(shí)間為1.6 ms，線性梯度變化區(qū)間為2 %～95 %。13C-qNMR 采集條件：反轉(zhuǎn)門控去耦脈沖序列zgig，掃描次數(shù)NS=8 192，譜寬SW=230 ppm。在對(duì)譜圖進(jìn)行處理之前，先進(jìn)行相位校正和基線調(diào)平。所有譜圖均采用Topspin 4.0.8軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 厚樸醇提物核磁分析 厚樸醇提物的核磁信號(hào)相對(duì)比較簡(jiǎn)單，測(cè)試溶劑：氘代甲醇。其1H-NMR（見圖1）在芳香區(qū)域顯示一組典型的1，2，4-三取代苯環(huán)信號(hào)：7.02（2H，m）、6.84（1H，d，J=8.8 Hz），在烯烴信號(hào)區(qū)域檢測(cè)到一組乙烯基：5.96（1H，m）、5.05（1H，brd，J=17.0 Hz）、5.00 （1H，brd，J=10.0 Hz），此外在高場(chǎng)區(qū)檢測(cè)到一個(gè)積分值為兩個(gè)氫的寬雙峰信號(hào)：3.32（2H，brd，J=6.7 Hz）。其13C-qNMR（見圖2）共檢測(cè)到9 個(gè)信號(hào)，包括高場(chǎng)區(qū)一個(gè)信號(hào)：40.4、芳香或烯碳區(qū)域檢測(cè)到8 個(gè)碳信號(hào)——來(lái)源于一個(gè)苯環(huán)與一個(gè)雙鍵基團(tuán)。經(jīng)過(guò)對(duì)上述氫碳核磁信號(hào)的仔細(xì)分析，可得出該結(jié)構(gòu)中含有苯丙素結(jié)構(gòu)單元，考慮到厚樸已報(bào)道化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，提示該結(jié)構(gòu)存在對(duì)稱因素——即完全對(duì)稱的苯丙素二聚體，調(diào)研相關(guān)文獻(xiàn)中的核磁數(shù)據(jù)，最終確定上述信號(hào)與厚樸酚一致［12］。

厚樸醇提物的主要成分是厚樸酚，根據(jù)氫信號(hào)積分值估測(cè)含量在90 %以上，而微量的次要成分為和厚樸酚。在核磁圖譜中已基本檢測(cè)不到其它化學(xué)成分的信號(hào)。

2.2 凹葉厚樸醇提物核磁分析 凹葉厚樸醇提物的核磁信號(hào)要復(fù)雜得多，其1H-NMR，見圖1，除了檢測(cè)到可歸屬于厚樸酚的信號(hào)外，還檢測(cè)到如下信號(hào)：在芳香區(qū)檢測(cè)到兩組苯環(huán)的1，2，4-三取代信號(hào)：7.22（1H，d，J=2.2 Hz）、7.20（1H， dd，J=8.2， 2.2 Hz）、6.78（1H，d，J=8.2 Hz）；6.98（1H，d，J=2.2 Hz）、6.89（1H，dd，J=8.2， 2.2 Hz）、6.77（1H，d，J=8.2 Hz）、在烯氫區(qū)域同樣檢測(cè)到兩組乙烯基信號(hào)，此外在高場(chǎng)區(qū)檢測(cè)到兩組雙峰信號(hào)：3.37（2H，brd，J=6.6 Hz）、3.29（2H， brd，J=6.6 Hz）。其13C-qNMR（見圖2）除了檢測(cè)到可歸屬于厚樸酚的信號(hào)外，還檢測(cè)到18 個(gè)信號(hào)（個(gè)別信號(hào)有重疊），包括高場(chǎng)區(qū)兩個(gè)信號(hào)：40.4、35.3、芳香或烯碳區(qū)域檢測(cè)到16 個(gè)信號(hào)——來(lái)源于兩個(gè)苯環(huán)與兩個(gè)雙鍵基團(tuán)。經(jīng)過(guò)對(duì)上述氫碳核磁信號(hào)的仔細(xì)分析，說(shuō)明該結(jié)構(gòu)是一個(gè)不對(duì)稱的苯丙素二聚體，經(jīng)與相關(guān)文獻(xiàn)中的核磁數(shù)據(jù)比較，可得出上述信號(hào)與和厚樸酚一致［13］。

圖1 凹葉厚樸（a）與厚樸（b）的醇提取物1H-NMR比較

圖2 凹葉厚樸（a）與厚樸（b）的醇提取物13C-qNMR比較

凹葉厚樸醇提物的其它化學(xué)成分要明顯多于厚樸醇提物。其1H-NMR 中檢測(cè)到一組特征性的反式烯氫信號(hào)：6.34（d，J=15.8 Hz）、7.58（d，J=15.8 Hz）、13C-qNMR 中檢測(cè)到一個(gè)不飽和羧酸碳信號(hào)：168.8，在144～150 ppm 區(qū)間可見若干碳信號(hào)，這些信息表明凹葉厚樸醇提物中還含有微量的咖啡酸（或者咖啡酸類似物）。此外，還可見葡萄糖的端基氫信號(hào)：4.72（d，J=7.9 Hz）、鼠李糖的端基氫信號(hào)：4.90（d，J=1.5 Hz），結(jié)合其碳譜中在100 ppm 附近的兩個(gè)糖端基碳以及60～80 ppm 區(qū)間的若干連氧碳信號(hào)，推測(cè)凹葉厚樸醇提物中還含有微量的酚苷類成分，且苷元很可能為咖啡酸（或者咖啡酸類似物）。

凹葉厚樸醇提物的主要成分是和厚樸酚與厚樸酚，前者占比稍多，根據(jù)氫信號(hào)積分值，估測(cè)它們的相對(duì)含量約為60 %∶40 %。需要特別指出的是，與厚樸醇提物有所不同，凹葉厚樸醇提物的核磁圖譜中還可見微量的酚苷類成分。

2.3 NMR 數(shù)據(jù)分析

2.3.1 NMR 的主成分分析 以10 個(gè)不同產(chǎn)地厚樸樣品的NMR 變量為數(shù)據(jù)矩陣，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后再主成分分析。結(jié)果前兩個(gè)主成分的特征值分別是71.0 %與28.0 %，兩個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.0 %。以前兩個(gè)主成分得分矢量繪制主成分得分圖，見圖3。由圖3 可知，10 個(gè)不同產(chǎn)地厚樸樣品，厚樸與凹葉厚樸各分為兩類。

2.3.2 NMR 的聚類分析 采用10 個(gè)不同產(chǎn)地厚樸NMR 變量為數(shù)據(jù)，以歐氏距離計(jì)算厚樸與凹葉厚樸的相似性近鄰矩陣X，以類平均法計(jì)算樣本的同現(xiàn)矩陣Y，由X 和Y 得同現(xiàn)相關(guān)系數(shù)為0.994 4［14-15］。進(jìn)行系統(tǒng)聚類，繪制系統(tǒng)聚類樹圖，結(jié)果見圖4。由圖4 分析可知，可將樣品聚為兩類，即厚樸與凹葉厚樸。

圖4 NMR變量數(shù)據(jù)的層次聚類樹圖

2.4 厚樸與凹葉厚樸DOSY 分析 DOSY 譜中同一化合物的所有峰都排列在一起，見圖5-6，這使得能夠更準(zhǔn)確地識(shí)別復(fù)雜混合物中的各種成分。水和氘代甲醇橫坐標(biāo)所對(duì)應(yīng)擴(kuò)散系數(shù)分別為-8.7和-8.9 m2/s，從具有相同分子量（266.33 g/mol）的厚樸酚與和厚樸酚的信號(hào)在擴(kuò)散系數(shù)處對(duì)齊。樣品的核磁譜中，主要信號(hào)來(lái)自厚樸酚與和厚樸酚，厚樸芳香區(qū)的大部分信號(hào)低于凹葉厚樸。

圖5 凹葉厚樸DOSY譜圖

圖6 厚樸DOSY譜

3 討論與結(jié)論

3.1 討論 本文主成分分析是數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到的結(jié)果。數(shù)據(jù)未標(biāo)準(zhǔn)化主成分分析前兩個(gè)主成分的特征值分別是98.1 %和1.7 %，累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.8 %，雖然高于經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理的累計(jì)貢獻(xiàn)率，但其兩者的主成分分類結(jié)果一致。

聚類分析時(shí)當(dāng)用歐氏距離，明氏距離或切氏距離時(shí)，與標(biāo)準(zhǔn)化歐氏距離層次聚類結(jié)果接近，但同現(xiàn)相關(guān)系數(shù)均小于標(biāo)準(zhǔn)化歐氏距離同現(xiàn)相關(guān)系數(shù)［14］。故以標(biāo)準(zhǔn)化歐氏距離的聚類算法為佳。

3.2 結(jié)論 本文應(yīng)用NMR（1H-NMR、13C-qNMR和DOSY）綜合分析厚樸兩種基原的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)信息、成分相對(duì)比例和特征信號(hào)描述，證明了厚樸醇提物的主要成分是厚樸酚，根據(jù)氫信號(hào)積分值估測(cè)含量在90 %以上。微量的次要成分為和厚樸酚。凹葉厚樸醇提物的主要成分是和厚樸酚與厚樸酚，前者占比稍多，根據(jù)氫信號(hào)積分值，估測(cè)它們的相對(duì)含量約為60 %∶40 %。需要特別指出的是，與厚樸醇提物有所不同，凹葉厚樸醇提物的核磁圖譜中還可見微量的酚苷類成分，可以對(duì)厚樸、凹葉厚樸進(jìn)行鑒別和區(qū)分。