NEC患兒腸道菌群的優勢菌屬及益生菌制劑療效分析

李琳琳，張艷波，張稱心

內蒙古醫科大學附屬醫院兒內科，內蒙古呼和浩特 010050

新生兒壞死性小腸結腸炎(NEC)是臨床常見的小兒獲得性疾病之一，有研究報道顯示，NEC是由多種原因造成的腸道黏膜損傷性疾病，由于局部組織的缺血以及缺氧癥狀，最終導致患兒的小腸以及結腸發生彌漫性或局部壞死，嚴重影響患兒的生命安全[1]。流行病學調查顯示，NEC主要好發于回腸遠端以及結腸近端[2]。目前對于NEC疾病的研究尚不明確，但是多數研究顯示，腸道的細菌感染是造成患兒疾病進展的重要因素，相比健康兒童，患兒的腸道菌群存在顯著的異常，但是在以往的研究中，對于人體正常的菌群培養難度較大，對于菌群多樣性的研究存在局限性[3]。隨著分子生物學技術的不斷進步，通過核酸檢測手段對人體腸道菌群進行分析已經成了一種成熟的方法，這對于患兒的治療有重要意義[4]。本研究對NEC患兒腸道菌群的菌屬分布情況及益生菌制劑的療效進行了分析，旨在為臨床治療提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年2月至2020年2月于本院治療的30例NEC患兒作為觀察組，男14例、女16例，日齡(18.37±3.23)d；另外，選取同期于本院體檢的健康兒童30例作為對照組，男17例、女13例，日齡(18.43±3.51)d。兩組間性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。采用隨機數字表法，將觀察組患兒又分為A組和B組，各15例，兩組患兒的一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。所有患兒家屬均簽署知情同意書，本研究經本院倫理委員會審批通過。NEC患兒納入標準：(1)符合Bell-NEC臨床診斷標準[5]；(2)患兒的胎齡均在37周以上；(3)入院前未使用腸道益生菌制劑；(4)入院前未在其他醫院進行治療。排除標準：(1)腸道畸形；(2)新生兒肺炎；(3)高膽紅素血癥；(4)腸道先天性疾病；(5)慢性腹瀉。對照組納入標準：(1)無腸道疾病；(2)胎齡均在37周以上。排除標準：(1)腸道出現異常情況者；(2)入院前使用腸道益生菌制劑。

1.2方法

1.2.1腸道菌群的PCR檢測及分析 采集納入兒童的新鮮糞便標本，隨后稱取0.22 g糞便提取DNA,主要使用QLAamp STOOL minikit試劑盒進行，同時對兒童的DNA 16S rDNA V3高變區域進行PCR擴增，上游引物序列為5′-CGCCCCGGGCGCGCCCCCGGGCGCGGGCGCGCCCACGCG-3′，下游引物序列為5′-ATTACGCGTGCGTAC-3′。PCR擴增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃擴增30 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共30個循環；72 ℃延伸5 min。擴增完成后，及時對兒童的擴增樣品進行變性梯度凝膠電泳分析，然后，采用SYBR Green進行染色，30 min后，使用紫外透射儀器對兒童的凝膠色帶進行觀察，分析其優勢條帶[6]。

1.2.2治療方案 A組患兒采用酪酸梭菌二聯活菌散劑(山東科興生物制品有限公司)聯合奧曲肽(浙江蘇泊爾制藥有限公司)治療，B組患兒僅采用奧曲肽治療，兩組患兒均治療1周。對照組不采取任何治療措施。

1.2.3糞便標本的培養 取患兒的新鮮糞便進行糞便培養，取上述標本1 mL，溶于99 mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩搖勻，使用接種環分別對兩組患兒樣本接種于MRS培養皿中[8]，35～37 ℃培養72 h，通過菌落形態對腸道雙歧桿菌、腸球菌、乳酸桿菌以及真桿菌的菌落數量進行統計。MRS培養皿由江蘇康典提供，操作嚴格按照說明書進行。

1.3觀察指標 (1)對觀察組和對照組兒童的腸道菌群的豐富度進行比較。(2)對觀察組和對照組兒童的腸道菌群優勢菌屬進行分析。(3)比較A、B兩組患兒的治療效果。治療效果評價標準[7]：患兒大便次數以及性狀恢復正常，臨床癥狀消失為顯效；臨床癥狀明顯改善，大便次數和性狀改善則為有效；大便性狀、次數以及臨床癥狀均未達到明顯改善則為無效。總有效率=(顯效例數+有效例數)/總例數×100%。(4)比較A、B兩組治療前后的腸道菌群:分別對治療前后的乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、真桿菌的菌落數進行比較。

2 結 果

2.1觀察組和對照組腸道菌群豐富度比較 觀察組患兒的腸道菌群的豐富度(7.36±2.33)顯著低于對照組(14.16±2.31)，差異有統計學意義(t=11.352,P<0.001)。

2.2觀察組和對照組腸道菌群優勢菌屬分析 觀察組和對照組兒童腸道菌群優勢菌屬的條帶相似度接近100%，觀察組雙歧桿菌、大腸埃希菌呈下降趨勢，見表1。

表1 觀察組和對照組兒童腸道菌群優勢菌屬分析

2.3A、B兩組患兒的治療效果比較 經過1周治療后，A組患兒的治療總有效率顯著高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患兒的治療效果比較[ n(%)]

2.4A、B兩組患兒治療前后腸道菌群的比較 治療前，兩組患兒糞便中的乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、真桿菌的菌落數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。治療后，兩組患兒糞便中的乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、真桿菌菌落數比治療前均有所升高(P<0.05)，且A組患兒乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、真桿菌菌落數高于B組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患兒治療前后腸道菌群的比較

3 討 論

腸道菌群平衡對于機體維持健康狀態具有重要的意義[9-11]。腸道菌群失調可能影響腸道細菌的正常生長及平衡，造成NEC的發生[12]。有研究報道，腸道菌群不僅有利于營養物質的吸收，同時通過對脂肪的分解，有利于脂肪組織在機體各臟器的有效分布，對于調節腸道上皮細胞的屏障作用具有積極的意義[13]。通過穩定的腸道菌群，加強腸道上皮細胞的屏障功能，建立先天性以及獲得性免疫，對于機體維持正常的生理功能具有重要意義[14-15]。由于受到檢查條件的限制，自然環境中99%的微生物培養都較難適用于常規檢測[16]。通過對兒童標本進行傳統微生物培養檢測，僅能對兒童的腸道菌群中的個別菌屬進行分析[17]，無法用于對兒童腸道菌群多樣性的準確分析。隨著分子生物學技術的不斷發展，通過對腸道細菌核酸物質的分析，可以對腸道菌群進行完整分析，對了解疾病的發生機制具有重要意義。

本研究對健康兒童及NEC患兒的腸道菌群豐富度以及優勢菌群進行了分析。觀察組腸道菌群豐富度顯著下降，而兩組兒童腸道菌群的優勢菌屬的相似度接近100%。NEC患兒的腸道菌群中，雙歧桿菌和大腸埃希菌均呈下降趨勢。在疾病狀態下，患兒的益生菌優勢地位減弱[18]，這對于患兒的腸道上皮細胞損傷會有促進作用[19]。

在對NEC患兒的治療中，奧曲肽不僅可以降低患兒胃酸以及消化液的分泌量，同時還減少了胃腸道的蠕動，進一步緩解了患兒的臨床癥狀。這些作用在短期內雖然可以使患兒的臨床癥狀得到有效緩解，但患兒的局部病灶由于上皮細胞壞死造成的炎性反應仍有可能得不到有效控制，同時，患兒腸道菌群失衡，致病性微生物的分泌物還會不斷刺激患兒的上皮細胞。通過對患兒采用益生菌制劑輔助治療，可改善患兒腸道菌群豐富度，對于維持益生菌的優勢地位具有重要價值。本研究中，對患兒采用益生菌聯合奧曲肽治療，治療后的患兒腸道菌群中益生菌的菌落數明顯恢復，對于患兒康復具有積極作用。

綜上所述，NEC患兒腸道菌群表現為雙歧桿菌及大腸埃希菌降低的趨勢，通過采用益生菌制劑輔助治療，酪酸梭菌二聯活菌散劑聯合奧曲肽治療患兒的效果更好，建議臨床推廣應用。但本研究納入的樣本量較小，還需要進一步地擴大樣本量進行研究。