基于生物信息學(xué)分析卵巢癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度及其與預(yù)后的關(guān)系

熊 璐，苑雪萍，徐 沖，許 琳，韓旭東

北京市中關(guān)村醫(yī)院病理科,北京 100190

卵巢癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤。盡管近年來(lái)卵巢癌的手術(shù)和化學(xué)療法取得了較大進(jìn)步，但是其發(fā)病率和病死率仍呈逐年上升的趨勢(shì)。全世界每年新診斷出超過(guò)23萬(wàn)例患者和超過(guò)15萬(wàn)名女性死于卵巢癌[1-3]，卵巢癌患者的5年存活率僅為47%[4]。關(guān)于卵巢癌的治療，腫瘤細(xì)胞減滅手術(shù)和化療藥物鉑類、紫杉醇等治療是晚期卵巢癌患者的一線療法。這種標(biāo)準(zhǔn)治療方案在晚期卵巢癌中的完全反應(yīng)率可達(dá)40%～60%，但是在18個(gè)月后復(fù)發(fā)的患者超過(guò)了90%，并且出現(xiàn)對(duì)化療藥物耐藥，最終死于卵巢癌[5]。由此可見(jiàn)，卵巢癌的預(yù)后仍有待進(jìn)一步提高，探索新的治療靶點(diǎn)和手段是十分必要的。

隨著腫瘤免疫治療的進(jìn)展，腫瘤與免疫的相關(guān)性受到越來(lái)越多的重視，腫瘤中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞水平與腫瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展和患者結(jié)局有關(guān)，成為近年研究的焦點(diǎn)[6-7]。從免疫學(xué)角度看，卵巢癌患者紊亂的免疫功能在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[8-9]。有學(xué)者提出了從復(fù)雜組織的基因表達(dá)譜中計(jì)算免疫細(xì)胞組成的方法，該方法在結(jié)直腸癌、肺癌、濾泡淋巴瘤中通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)得到很好的驗(yàn)證，能大規(guī)模應(yīng)用于基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的分析[10-11]。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中卵巢癌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，通過(guò)R軟件計(jì)算了卵巢癌樣本中免疫細(xì)胞的組成，并進(jìn)一步分析了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來(lái)源 本研究的卵巢癌芯片數(shù)據(jù)來(lái)源于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的GSE63885數(shù)據(jù)集，GSE63885數(shù)據(jù)集中包含101例卵巢癌患者的組織RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)(由GPL570平臺(tái)注釋)。本課題組下載該數(shù)據(jù)集RNA-seq的Counts矩陣，同時(shí)還包括患者臨床分期、病理分級(jí)、生存狀態(tài)、生存時(shí)間等信息。

1.2方法

1.2.1ssGSEA免疫基因集分析及免疫評(píng)分 通過(guò)ssGSEA算法計(jì)算每個(gè)樣本的免疫浸潤(rùn)程度，下載分析所需要的gmt格式基因集數(shù)據(jù)后，使用R包GSVA對(duì)GSE63885中的樣本進(jìn)行免疫評(píng)分，共包含29項(xiàng)免疫相關(guān)評(píng)分。

1.2.2預(yù)后分析 使用survival程序包分析各項(xiàng)免疫評(píng)分與生存預(yù)后的關(guān)系。根據(jù)各項(xiàng)評(píng)分的中位數(shù)(作為界值)將患者分為高分組和低分組，然后篩選高分組與低分組預(yù)后生存情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的免疫評(píng)分項(xiàng)并繪制生存曲線進(jìn)行展示。

1.2.3采用Cibersort軟件計(jì)算免疫細(xì)胞構(gòu)成 采用limma應(yīng)用程序包的Normalize Between Arrays函數(shù)對(duì)GSE63885卵巢癌測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，即組間歸一化處理，校正后的數(shù)據(jù)通過(guò)Cibersort軟件的“反卷積法”得到22種免疫細(xì)胞在腫瘤組織中的占比數(shù)據(jù)，根據(jù)P<0.05篩選預(yù)測(cè)合格的樣本，繪制免疫細(xì)胞占比相關(guān)性熱圖，同時(shí)根據(jù)與預(yù)后相關(guān)的免疫評(píng)分項(xiàng)進(jìn)行分組，繪制免疫浸潤(rùn)細(xì)胞小提琴圖。

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌樣本臨床信息 本研究項(xiàng)目的數(shù)據(jù)共包括101例卵巢癌患者信息。病理分級(jí)方面，G3的患者居多(占50.5%)；臨床分期中，Ⅲ期患者較多(占63.4%)。此外，從乳腺癌易感基因1(BRCA1)和TP53基因突變情況可知，TP53基因突變是卵巢癌患者的主要特征，85.1%的患者檢測(cè)到突變位點(diǎn)，另有30.7%的患者有BRCA1突變。見(jiàn)表1。

表1 卵巢癌患者臨床信息[ n(%)]

續(xù)表1 卵巢癌患者臨床信息[ n(%)]

2.2卵巢癌樣本免疫評(píng)分 101例卵巢癌樣本的免疫評(píng)分熱圖見(jiàn)圖1。免疫細(xì)胞相關(guān)基因集有樹突狀細(xì)胞(DCs，分為aDCs、iDCs、pDCs)、抗原呈遞(共抑制)細(xì)胞(APC co-inhibition)、抗原呈遞(共刺激)細(xì)胞(APC co-stimulation)、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、共抑制T細(xì)胞(T cell co-inhibition)、共刺激T細(xì)胞(T cell co-stimulation)、輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞，分為Th1細(xì)胞和Th2 細(xì)胞)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)、濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)、調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)；免疫分子相關(guān)基因集有趨化因子受體(CCR)、檢查點(diǎn)(Check point)、細(xì)胞活化因子(Cytolytic activity)、人類白細(xì)胞抗原(HLA)、副炎癥(Parainflammation)、促炎性因子(Inflammation promoting)、主要組織相容性復(fù)合體1(MHC classⅠ)、Ⅰ性干擾素(TypeⅠ IFN reponse)、Ⅱ性干擾素(Type Ⅱ IFN reponse)。

注：cells表示細(xì)胞；Mast cells為肥大細(xì)胞；Macrophages為巨噬細(xì)胞；Neutrophils為中性粒細(xì)胞。

2.3免疫評(píng)分預(yù)后分析 以各項(xiàng)免疫評(píng)分的中位數(shù)為界值，將患者分為高、低分組，結(jié)合患者的生存時(shí)間和生存狀態(tài)數(shù)據(jù)，采用Kaplan-Meier Log-rank法對(duì)各項(xiàng)免疫評(píng)分與生存預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析。Tfh評(píng)分與患者的生存預(yù)后相關(guān)(P=0.026 7<0.05)，見(jiàn)圖2，高Tfh評(píng)分組患者較低分組生存預(yù)后更佳。

圖2 Tfh評(píng)分相關(guān)生存曲線

2.4卵巢癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析 通過(guò)Cibersort軟件獲得各樣本的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比例，共66例樣本符合篩選標(biāo)準(zhǔn)(P<0.05)，繪制66例樣本的免疫細(xì)胞占比柱狀圖和免疫細(xì)胞占比相關(guān)性熱圖。卵巢癌組織中浸潤(rùn)水平較高的細(xì)胞是M2型巨噬細(xì)胞(0.180±0.085)%、漿細(xì)胞(0.114±0.090)%、CD8+T細(xì)胞(0.105±0.066)%。在卵巢癌組織中，免疫細(xì)胞占比相關(guān)系數(shù)(r)較大的包括γδT細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞(r=0.63，P<0.05)，嗜酸性粒細(xì)胞和Tfh(r=0.65，P<0.05)，Tfh分別與M1型巨噬細(xì)胞、γδT細(xì)胞呈較強(qiáng)正相關(guān)(r=0.54，P<0.05)，B記憶細(xì)胞和未成熟的B細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.51，P<0.05)，見(jiàn)圖3。

注：B cells naive為未成熟的B細(xì)胞；B cells memory為記憶B細(xì)胞；Plasma cells為漿細(xì)胞；T cells CD8為CD8+T細(xì)胞；T cells CD4 naive為未成熟的CD4+T細(xì)胞；T cells CD4 memory resting為靜息記憶CD4+T細(xì)胞；T cells CD4 memory activated為活化記憶CD4+T細(xì)胞；T cells follicular helper為Tfh；Tregs為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；T cells gamma delta為γδT細(xì)胞;NK cells resting為靜息NK細(xì)胞；NK cells activated為活化NK細(xì)胞；Moncytes為單核細(xì)胞；Macrophages為巨噬細(xì)胞；Dendritic cells resting為靜息樹突細(xì)胞；Dendritic cells activated為活化樹突細(xì)胞；Mast cells resting為靜息肥大細(xì)胞；Mast cells activated為活化肥大細(xì)胞；Eosinophils為嗜酸性粒細(xì)胞;Neutrophils為中性粒細(xì)胞；**表示P<0.01，*表示P<0.05。

根據(jù)Tfh評(píng)分將患者分為Tfh高分組和低分組，比較兩組間的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況差異，繪制小提琴圖，見(jiàn)圖4。Tfh高分組的漿細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯高于低分組(P<0.05)，而M2型細(xì)胞的浸潤(rùn)程度則明顯低于低分組(P<0.05)。

注：B cells naive為未成熟的B細(xì)胞；B cells memory為記憶B細(xì)胞；Plasma cells為漿細(xì)胞；T cells CD8為CD8+T細(xì)胞；T cells CD4 naive為未成熟的CD4+T細(xì)胞；T cells CD4 memory resting為靜息記憶CD4+T細(xì)胞；T cells CD4 memory activated為活化記憶CD4+T細(xì)胞；T cells follicular helper為Tfh；Tregs為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；T cells gamma delta為γδT細(xì)胞;NK cells resting為靜息NK細(xì)胞；NK cells activated為活化NK細(xì)胞；Moncytes為單核細(xì)胞；Macrophages為巨噬細(xì)胞；Dendritic cells resting為靜息樹突細(xì)胞；Dendritic cells activated為活化樹突細(xì)胞；Mast cells resting為靜息肥大細(xì)胞；Mast cells activated為活化肥大細(xì)胞；Eosinophils為嗜酸性粒細(xì)胞;Neutrophils為中性粒細(xì)胞；**表示P<0.01，*表示P<0.05。

3 討 論

本研究利用GEO數(shù)據(jù)集中卵巢癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行免疫評(píng)分，根據(jù)免疫評(píng)分中位數(shù)將卵巢癌患者分為高分組和低分組，發(fā)現(xiàn)Tfh評(píng)分與卵巢癌患者的生存預(yù)后相關(guān)，Tfh高分組患者較低分組預(yù)后更佳。Tfh是輔助B細(xì)胞功能的主要T細(xì)胞亞群，可通過(guò)抗原呈遞與新激活的B細(xì)胞相互作用，Tfh與自身免疫性疾病、免疫缺陷和腫瘤等疾病密切相關(guān)。研究表明，Tfh在乳腺癌的炎性浸潤(rùn)灶內(nèi)大量存在，Tfh的存在可以改善存活率，同時(shí)減弱免疫抑制[12]。在大腸癌中也有浸潤(rùn)性Tfh的報(bào)道，其水平與患者的生存時(shí)間呈正相關(guān)[13-14]。結(jié)合本研究的結(jié)果進(jìn)行分析，Tfh在腫瘤組織中的高水平浸潤(rùn)可能有利于患者的預(yù)后。

本研究通過(guò)Cibersort軟件分析了卵巢癌組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)水平最高的是M2型巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是具有可塑性和多能性的免疫細(xì)胞，M2型巨噬細(xì)胞可分泌抑制性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等，從而下調(diào)免疫應(yīng)答[15]。在腫瘤免疫微環(huán)境中，M2型巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生密切相關(guān)。既往研究顯示，卵巢癌細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，使血液中的單核細(xì)胞聚集在卵巢癌組織中并分化為巨噬細(xì)胞。卵巢癌細(xì)胞可以分泌大量的巨噬細(xì)胞集落刺激因子-1(CSF-1)，從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞極化[16]。Tfh高分組中漿細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯高于低分組，而M2型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度則明顯低于低分組。通過(guò)對(duì)M2巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量越多，晚期卵巢癌患者的預(yù)后就越差[17]。通過(guò)對(duì)卵巢癌的M1和M2巨噬細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，M1/M2巨噬細(xì)胞比例較高的患者預(yù)后較好，這表明M2型巨噬細(xì)胞在卵巢癌的進(jìn)展中起重要作用[18]。NK細(xì)胞是具有直接殺傷功能的天然免疫效應(yīng)細(xì)胞，在清除腫瘤細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，其潛在的癌癥免疫治療靶點(diǎn)引起人們的廣泛關(guān)注[19-20]。本研究也顯示，在Tfh高分組中活化NK細(xì)胞的浸潤(rùn)水平明顯高于低分組，這可能也是Tfh高分組患者預(yù)后更好的原因。

本研究通過(guò)ssGSEA方法和Cibersort軟件，利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析卵巢癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況及其與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)卵巢癌中存在不同程度的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，Tfh可能為影響卵巢癌患者預(yù)后的因素。同時(shí)這種方法可以為研究免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況與腫瘤的關(guān)系提供新的研究手段。