腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p檢測對胃癌腹膜轉移的診斷價值

張建新，田 珍

1.荊門市第二人民醫院消化內一科，湖北荊門 448000；2.荊門市第一人民醫院消化內科，湖北荊門 448000

胃癌是全世界與癌癥相關的死亡的第二大最常見原因[1]。腹膜是胃癌轉移和復發的最常見部位，由腹膜癌細胞擴散引起的惡性腹水與不良預后有關[2]。目前，尚無可靠的預測因素可預測胃癌患者發生腹膜惡性腹水。微小RNA(miRNA)是長度為19～23個核苷酸的非編碼RNA，可作為基因表達的轉錄后調節子，并在許多生物學過程的控制中發揮重要作用，包括細胞分化、增殖和凋亡[3]。外泌體是小膜狀囊泡，與細胞免疫反應有關，包含大量的RNA，并且可能參與免疫非依賴性調節機制[4]。含有miRNA的外泌體代表了一種新的細胞間信號傳導機制，對其進行研究有助于更加深入地了解癌細胞轉移至腹膜的機制[5]。TOKUHISA等[6]發現，胃癌腹膜轉移患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的相對表達水平異常。然而，對腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的診斷價值仍然所知甚少?；诖?，本研究旨在探討腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p檢測對胃癌腹膜轉移的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2017年5月至2020年6月荊門市第二人民醫院收治的胃癌患者298例納入研究。其中胃癌腹膜轉移患者87例作為轉移組，男57例、女30例，平均年齡(57.32±21.45)歲；胃癌非腹膜轉移患者132例作為無轉移組，男94例、女38例，平均年齡(58.43±19.60)歲，淋巴結轉移71例、血行轉移61例。胃癌預后良好患者79例作為對照組，男59例、女20例，平均年齡(57.04±20.85)歲。所有納入研究的患者均已通過對從原發灶獲取的組織活檢樣品的病理學檢查診斷為胃癌。排除標準：(1)有嚴重心、肝、腎功能損害者；(2)服用過內分泌藥物者；(3)患有其他腫瘤者；(4)患有精神疾病者。各組一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批，受試者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1腹膜灌洗液外泌體的獲取 患者行開腹手術后，將100 mL生理鹽水倒入道格拉斯氣袋中，并在手術切除腫瘤之前收集腹膜灌洗水。為了去除大的細胞顆粒和細胞碎片，將腹膜灌洗液在4 ℃下以2 000×g離心15 min，然后通過0.22 μm直徑的過濾器(Millipore)過濾。為了沉淀外泌體，將樣品在4 ℃條件下，以110 000×g離心70 min。將外泌體沉淀物用11 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，然后再次離心，棄上清后獲得腹膜灌洗液外泌體。

1.3RNA抽取與實時熒光定量PCR 根據制造商的說明，使用miRNeasy mini試劑盒(Qiagen)從外泌體中提取總RNA，然后將其儲存在-80 ℃直至需要進一步分析。使用Agilent Bioanalyzer 2100(安捷倫科技公司)評估總外泌體RNA的質量、濃度和大小。在分析之前，使用RNA 6000 Pico試劑盒(安捷倫科技公司)提取總RNA。使用TaqMan miRNA RT試劑盒進行cDNA第一鏈的合成。使用TaqMan microRNA試劑盒和ABI 7500儀器定量分析(Life科技公司)miR-21、miR-320c、miR-1225-5p、miR-16。所有反應均重復3次。將目標miRNA的表達水平用于miR-16的表達水平進行標準化處理，將miR-16用作穩定表達的對照。

2 結 果

2.13組患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的相對表達水平 轉移組腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的相對表達水平均高于無轉移組和對照組(P<0.05)，無轉移組與對照組腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的相對表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、 miR-1225-5p的相對水平比較

2.2患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p檢測的診斷價值 為了評估腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p檢測用于胃癌腹膜轉移與未轉移的鑒別診斷價值，繪制受試者工作特征(ROC)曲線。當miR-21的cut-off值為1.116時診斷的靈敏度為93%，特異度為93%；miR-320c的cut-off值為0.690時診斷靈敏度為91%，特異度92%；miR-1225-5p的cut-off值為0.854時的診斷靈敏度為92%，特異度為91%。見表2。

表2 胃癌腹膜轉移患者與無轉移患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p檢測的診斷價值

2.3腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p對胃癌腹膜轉移的聯合診斷 確診為胃癌腹膜轉移的患者為真陽性，未患有胃癌腹膜轉移的為真陰性。以miR-21的陽性臨界值為1.116、miR-320c的陽性臨界值為0.690、miR-1225-5p的陽性臨界值為0.854為診斷標準進行聯合診斷，三者滿足其一者為聯合診斷陽性，反之則為聯合診斷陰性。腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p聯合對胃癌腹膜轉移的診斷的靈敏度為94.25%(82/87)，特異度為90.99%(192/211)，準確性為91.95%(274/298)，見表3。

表3 腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR- 1225-5p對胃癌腹膜轉移的聯合診斷(n)

3 討 論

即使有R0切除，伴有漿膜浸潤的胃癌的預后仍然很差，原因在于其復發率很高，尤其是腹膜轉移[7]。胃癌并發腹膜轉移是最復雜的胃癌復發類型，因為它既難以預測也難以診斷。盡管腹水是最常見的胃癌并發腹膜轉移癥狀，但許多患有腹膜轉移的胃癌患者并未出現腹水[8]。在基于影像的診斷方法中，高速螺旋CT被廣泛用于評估胃癌的術前分期和治療后的隨訪[9]。然而，在腹膜轉移的情況下，其診斷準確性不足，主要是因為靈敏度低[10]。使用PET-CT在胃癌中進行腹膜轉移診斷也存在爭議，因為據報道FDG-PET對胃癌中腹膜轉移的檢測靈敏度較差[11-12]。腹腔灌洗液已成為診斷和預測胃癌中腹膜轉移的下一個目標。術中收集的腹腔灌洗液的細胞學檢查可用于預測腹膜復發，且在日本曾用于胃癌分期[13]。但是，有研究報道，腹腔灌洗液細胞學不能顯示出預測和檢測腹膜轉移所需的敏感性，并建議使用分子診斷方法(例如實時熒光定量PCR)來檢測腹膜轉移中的微轉移[14]。在一項多中心的前瞻性研究中，通過實時熒光定量PCR評估了編碼癌胚抗原(CEA)和細胞角蛋白20(CK-20)的基因的mRNA表達，可用于預測胃癌的總體存活率和腹膜轉移[15]。然而，基于mRNA的診斷方法的缺點是在外科手術過程中mRNA的高度可降解性。相反，包裹在外泌體中的miRNA保持穩定并可以在體液中循環很長時間，這些體液包括血清、血漿、唾液、尿液、母乳和眼淚。因此，腹腔灌洗液外泌體中的miRNA具有較高的診斷價值。

本研究發現胃癌腹膜轉移患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的相對表達水平均高于胃癌非腹膜轉移患者和胃癌預后良好患者(P<0.05)，胃癌非腹膜轉移患者與胃癌預后良好患者腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。因此，腹膜轉移特異性的miRNA，這種特異性可讓其成為潛在的生物標志物。FABBRI等[16]報道，癌癥釋放外泌體中的miR-21和miR-29a通過與周圍免疫細胞中的TLRs結合并激活以及誘導促轉移性炎性反應，影響腫瘤的生長和擴散。這支持了腫瘤來源的外泌體有助于轉移前微環境形成的觀點。這表明癌細胞來源的外泌體有助于在腹膜中形成轉移前小生境，從而支持胃癌根治性切除術后腹膜浸潤。miR-1225-5p靶向作用于多囊腎病基因PKD1，該基因在常染色體顯性多囊腎病中經常突變[17]。因此，miR-1225-5p可能影響該病的進展。然而，miR-1225-5p與癌癥的關系尚不清楚。miR-21和miR-1225-5p有助于在腹膜中為轉移癌細胞的擴散和沉降構建一個轉移前小龕，因此可能造成治療性胃癌切除術后腹膜轉移的易發性。

綜上所述，腹腔灌洗液外泌體中miR-21、miR-320c、miR-1225-5p的表達水平檢測可作為診斷胃癌腹膜轉移的潛在方法，有助于采取更有效的預防和治療措施。