非小細胞肺癌病人PD-L1表達與臨床及影像學特征關系

方 園，謝 軍，章俊強，徐從景

肺癌可分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細胞肺癌，其中NSCLC占80%～85%[1]。近年程序性死亡因子受體-1(programmed cell death-1，PD-1)的發現為部分NSCLC病人的治療帶來了曙光。PD-1有2個配體，其中PD-L1作為其主要配體之一，是B7蛋白家族成員之一[2]。研究[3]表明，大多數癌癥病人使用PD-1/PD-L1抑制劑治療均會獲益，且表達程度越高，可能獲益越大。PD-L1高表達NSCLC病人可單獨使用免疫檢查點抑制劑治療，低表達或不表達病人則可能需要聯合化療。但PD-L1的檢測技術要求較高，大部分醫院仍不能開展，且部分病人拒絕或無法進行組織標本的取材；此外，檢測費用昂貴，部分病人沒有能力檢測等原因，均給PD-L1檢測帶來了困難。因此，探討PD-L1表達水平與病人的臨床特點及影像學特點相關性顯得尤為重要[4-5]。本研究回顧性分析行PD-L1檢測的NSCLC病人CT表現及臨床特征，探討NSCLC病人PD-L1表達與臨床及胸部影像學特征的關系，以期為NSCLC病人的臨床免疫治療提供一定參考?，F作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 利用安徽省立醫院病歷系統，收集2019年9月1日至2020年3月31日就診于安徽省立醫院NSCLC病人共187例。納入標準：有完整的病理標本且確診為NSCLC；預計生存期>3個月；在我院病理科行PD-L1檢測，且行PD-L1檢測前1個月內進行過胸部CT掃描。排除標準：病理為小細胞肺癌；影像學資料缺失；全身病變明顯或合并其他腫瘤。根據病人PD-L1表達的情況，將病人分為高表達組40例、低表達組65例和陰性組82例，其中高表達組和低表達組作為陽性組。

1.2 PD-L1檢測 187例病人中，74病人標本來源于外科手術，44例來源于氣管鏡活檢，58例來源于肺穿刺標本，另有8例來源于淋巴結穿刺，3例來源于胸水包埋沉渣標本，還有1例為外院白片。PD-L1檢測方法采用免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)22C3 pharmDx 法。

1.2.1 儀器與試劑 采用Dako Autostainer Link 48全自動免疫組織化學染色系統。主要試劑：一抗為單克隆小鼠抗PD-L1 克隆22C3，小鼠linker，顯色試劑為改良的碘氧化法活化辣根過氧化物酶(HRP)、二氨基聯苯胺(DAB)+底物緩沖液、DAB+顯色劑、DAB增強劑。

1.2.2 檢測方法 所有組織標本用10%中性甲醛固定，固定時間為6～24 h，將固定后的標本用石蠟包埋，最后再將組織或細胞塊連續切片為3 μm厚度的標本。進行染色，包括脫蠟、水化、抗原修復過程。將切片好的標本于60 ℃烤片1 h，使用無水乙醇及二甲苯脫蠟，隨后用預熱的低pH抗原修復液在97 ℃下孵育30 min，將含有切片的切片架置于Autostainer Link 48儀器，選擇IHC 22C3 pharmDx 方案，進行自動染色。采用EnVision FLEX 兩步免疫組織化學染色技術進行染色。首先Bloking室溫(25 ℃)孵育5 min，一抗繼續在25 ℃下孵育0.5 h，隨后使用EnVision FLEX聯合小鼠linker在25 ℃下孵育0.5 h，再使用EnVision FLEX/HRP相同溫度下孵育0.5 h。采用DAB顯色室溫下孵育10 min，并使用DAB增強劑室溫下再次孵育5 min進行顯色增強，最后使用EnVision FLEX蘇木素復染。染色完成的切片經乙醇、二甲苯脫水透明后，使用中性樹膠封固。制好的切片置于20～25 ℃避光儲存。

1.2.3 結果判讀 使用IHC 22C3 pharmDx 法對腫瘤組織進行染色，染色強度評分標準參照Dako公司提供的標準檢測試劑盒的判讀標準進行判讀，可分為4個等級：0，陰性；1+，弱強度；2+，中等強度；3+，高強度?！?+均計入染色結果。

標本的PD-L1表達水平采用腫瘤比例評分(tumor proportion score,TPS)法判定，由2位及以上病理醫生，在對病人任何既往臨床資料和病理結果均不知情的情況下對檢測結果進行評估。使用TPS評價PD-L1的表達程度，即染色陽性的腫瘤細胞數占總活腫瘤細胞數的比例。進行評估時應引起重視的是：TPS染色陽性細胞應只包括可見的腫瘤細胞部分或完整的細胞膜染色，不包括染色的細胞質及免疫細胞。因此，需要有經驗的病理科醫生進行評估。選取1%及50%兩個截斷值對TPS染色程度進行分類。(1)TPS<1%：PD-L1表達陰性，即表達PD-L1呈現局部或全部細胞膜染色(≥1+)的腫瘤細胞數占所有腫瘤細胞數的比例<1%；(2)TPS 1%～<50%：PD-L1低表達，即呈現局部或全部細胞膜染色(≥1+)的腫瘤細胞數占所有腫瘤細胞數的比例1%～<50%；(3)TPS≥50%：PD-L1高表達，即呈現局部或全部細胞膜染色(≥1+)的腫瘤細胞數占所有腫瘤細胞數的比例≥50%(見圖1)。

1.3 胸部CT檢查方法 采用GE Discovery CT750、light speed VCT、optima CT660、NeuViz 128及philips Brilliance 64進行CT 檢查，掃描范圍包括病人胸廓入口至雙側腎上腺水平整個胸腔。掃描條件：管電壓120 kV，管電流自動配置，掃描層厚為5 mm每層。肺窗窗位為1 500 Hu，窗寬-500 Hu；縱膈窗窗位300 HU，窗寬35 Hu。

影像學評估由至少2名具有執業資格的影像學醫師進行審核，當意見不一致時由高年資醫師再次進行讀片復核。肺癌典型影像學特點較多，經查閱資料[6]及反復篩選，最終選取了以下11個胸部CT形態特征進行定性評價，包括分葉、磨玻璃影、解剖學分型、胸膜牽拉征、胸膜增厚、氣管支氣管侵犯、毛刺、胸腔積液、多發結節、是否存在纖維化、貼近胸膜。

1.4 統計學方法 采用χ2檢驗和t檢驗。

2 結果

2.1 3組病人臨床資料比較 187例NSCLC病人中PD-L1陽性105例，陽性表達率56.1%。3組病人性別、年齡、吸煙史和病理類型差異均無統計學意義(P>0.05)，3組TNM分期差異有統計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 臨床資料在3組病人間比較[ n；百分率(%)]

2.2 高表達和低表達組病人影像學特征比較 高表達組和低表達組病人胸部CT表現中磨玻璃影、解剖學分型、胸膜牽拉征、胸膜增厚、多發結節、存在纖維化、貼近胸膜比例差異均無統計學意義(P>0.05)；而高表達組分葉、氣管支氣管侵犯、毛刺征、胸腔積液表現比例均較低表達組中多(P<0.05～P<0.01)(見表2)。高表達組病人典型影像學表現見圖2。

表2 胸部CT特征在高表達和低表達組病人間比較(n)

2.3 陽性組和陰性組病人影像學特征比較 陽性組和陰性組病人胸部CT表現中，腫瘤是否存在分葉、磨玻璃影、解剖學分型、氣管支氣管侵犯、胸腔積液差異均無統計學差異(P>0.05)；而陽性組多見單發結節、有毛刺征，陰性組則多存在肺纖維化、病灶貼近胸膜、胸膜牽拉征、胸膜增厚影像學表現，2組差異均有統計學意義(P<0.05～P<0.01)(見表3)。

表3 胸部CT特征在陽性組和陰性組病人間比較(n)

3 討論

PD-1屬于免疫球蛋白超家族中一員，相關實驗表明，PD-1可能參與了經典類型的程序性死亡[7]。PD-L1作為PD-1的主要配體之一，介導體內PD-1/PD-L1信號通路，腫瘤細胞可通過該途徑產生獲得性免疫逃逸?，F有的免疫治療，大部分都是通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路產生免疫反應，從而達到抗腫瘤的目的。

肺癌病人PD-L1高表達意味著對淋巴細胞產生負性調節作用，抑制機體免疫系統對腫瘤細胞的殺傷效應，進而促進了腫瘤進展。肺癌中PD-L1的表達與病人預后相關，PD-L1高表達病人往往預后不佳。近年來，PD-1/PD-L1抑制劑的出現給部分NSCLC病人帶來了新的希望。有研究[3]表明，不論肺癌病人PD-L1表達如何，使用PD-L1抑制劑治療均會獲益，而表達程度越高，可能獲益越大。PD-L1高表達的NSCLC病人可單獨使用免疫檢查點抑制劑治療，低表達或不表達病人則可能需要聯合化療。

既往研究中，PD-L1表達陽性率在0%～82%不等，且不同研究[8-9]中的PD-L1陽性率差異較大，說明影響PD-L1表達的因素較多，且可能與多種因素的相互作用及細胞的共表達有關。本研究中，PD-L1檢測陽性率為56.1%，在這一范圍內。關于PD-L1與臨床病理各因素之間的關系，KONISHI等[10]通過對52例經手術切除的NSCLC標本中PD-L1和PD-L2的表達進行了免疫組織化學檢測，結果顯示PD-L1表達與臨床病理變量和病人的術后生存均沒有明顯關系；AZUMA等[11]評估了164例經手術切除的NSCLC標本，發現在女性、從不吸煙者和腺癌病人中，PD-L1的表達明顯更高。國內有學者也對此進行了相關研究，陳麗娥等[12]以112例NSCLC病人作為研究對象，結果發現不吸煙、鱗癌病人PD-L1陽性率更高，但與年齡、性別、TNM分期無關。本研究根據PD-L1的表達水平對NSCLC病人進行分類，發現不同PD-L1表達與病人的性別、年齡、吸煙史、病理類型差異均無統計學意義，但TNM分期存在明顯差異，這可能體現了PD-L1的表達與疾病的進展相關。這些不一致的結果表明，PD-L1的表達可能因種族或居住情況而不同，并且可能有必要分析各亞組之間的臨床特征。

由于腫瘤細胞的異質性，各部位PD-L1表達均有可能不同，且隨著病情的發展及治療方式的不同存在動態變化[13]。但是反復多次有創活檢對于大部分病人都是不可接受且不現實的，且難以全面評估病人病情狀態。而且PD-L1表達檢測技術復雜、設備和檢測人員要求高、價格昂貴，只有少數省級醫院才能開展，縣市及醫院普遍尚未開展，加之價格昂貴，大部分NSCLC病人不能進行此項檢測。因此，迫切需要一種非侵入性、全面、易反復實施的模式，如CT技術。有研究[14]表明，影像學指標聯合臨床特征、流行病學、臨床癥狀所建立的診斷模型可作為肺癌臨床輔助診斷的一種優選方法。影像學特征在肺癌的診斷方面也有重要作用。有學者[15]在一項回顧性的研究中分析了394例肺腺癌病人PD-L1的表達與CT影像學之間的關系，其結果表明PD-L1表達不同，其影像學表現也有不同。王宇等[16]通過對肺腺癌病人行高分辨CT檢查發現，PD-L1陽性病人腫瘤較大、密度較高、界限清晰，且胸膜牽拉征、分葉及毛刺征發生率高。如果在NSCLC中建立了CT成像與PD-L1表達的關系，這可能有助于對PD-L1的表達進行動態評估。但關于此類研究的文章卻很有限，也難成定論。

本研究通過查閱相關文獻、評估肺癌中各個影像學特征的意義，分析了20余個肺癌相關影像學特征，最終篩選出以下11個研究指標：即腫瘤是否存在分葉、磨玻璃影、解剖學分型、胸膜牽拉征、胸膜增厚、氣管支氣管侵犯、毛刺、胸腔積液、肺癌多發結節、纖維化、病灶貼近胸膜。這些指標均具有一定的臨床意義，如胸膜牽拉征是內臟胸膜侵犯的常見癥狀[17]，且與腫瘤的浸潤程度有關，肺纖維化通常被視為長期吸煙后果。本研究回顧性分析187例病人PD-L1表達水平與影像學特征之間的關系，發現PD-L1高表達組較低表達組CT表現更容易出現分葉、支氣管侵犯、胸腔積液、毛刺征；而PD-L1陽性組和陰性組對比，陽性組多為單發結節、有毛刺征，陰性組則多出現肺纖維化、病灶貼近胸膜、胸膜牽拉征、胸膜增厚。這與國內學者的研究稍有分歧，可能與納入病人的病理類型不同有關。本研究中納入了一定比例的鱗癌病人，其對解剖學分型、氣管支氣管侵犯及病灶是否貼近胸膜均會產生一定影響。

綜上，本研究通過分析PD-L1表達差異與病人肺部影像學表現的關聯，以期通過臨床特征對病人PD-L1的表達做出預測，為一些缺乏檢測PD-L1的NSCLC病人的治療選擇提供參考。但本研究為單中心研究，且樣本量較小，其結果需要得到更多的驗證，其機制需要進一步探索。