重組人血小板生成素聯合大劑量地塞米松對原發性ITP病人Treg細胞及Th1、Th2細胞的影響

傅 磊，沈 磊，卞建軍，李 亮，蘇玉璇，左金曼，孟美麗，陸 堯，葛書亞，張伊莉

原發性免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是一種由自身抗體免疫介導血小板過度破壞所引起的血小板減少性疾病。病人可有體液免疫和細胞免疫異常，導致B淋巴細胞產生破壞血小板的抗體及CD8+細胞毒T細胞破壞血小板、使血小板生成障礙，是ITP的經典發病機制。目前ITP治療首選以地塞米松為主的糖皮質激素治療，但停藥后極易復發[1]。血小板生成素(TPO)受體激動劑可有效促進ITP病人骨髓巨核細胞的生成，迅速升高血小板，具有耐受性好、不良反應輕等優點[2]，臨床上重組人血小板生成素(rhTPO)應用最為廣泛。研究[3-4]顯示，人體免疫系統中輔助性T細胞(Th)可參與多種自身免疫性疾病的發生及發展，ITP病人也存在多種其他細胞免疫功能異常，T細胞功能紊亂可能在ITP的發病中起重要作用。有研究[5]發現，TPO受體激動劑能顯著改善ITP病人的T細胞功能。本研究觀察rhTPO聯合大劑量地塞米松治療對ITP病人的療效及其對調節性T細胞(Treg)和Th1細胞、Th2細胞的表達影響。現作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年1月至2020年1月我院收治的ITP病人82例。納入標準：(1)年齡≥18歲，男女不限；(2)符合ITP診斷標準[6]；(3)自愿接受住院治療并簽署知情同意書。排除標準：(1)妊娠或哺乳期女性；(2)合并有自身免疫性疾病等引起血小板減少疾病者；(3)有顱內出血者；(4)有血栓病史者；(5)合并嚴重肝、腎功能不全者或心肺功能障礙者；(6)有急性感染者；(7)有糖皮質激素和rhTPO應用禁忌證者。采用隨機數字表法分為觀察組42例和對照組40例。觀察組男23例，女19例；年齡(46.32±14.52)歲。對照組男21例，女19例；年齡(44.23±15.06)歲。2組病人性別、年齡具有可比性。本研究符合2013年修訂的《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 治療方法 觀察組給予rhTPO聯合大劑量地塞米松治療，其中rhTPO(沈陽三生制藥有限公司，國藥準字S20050048，生產批號201911131)15 000 U，皮下注射，每日一次，共14 d，在14 d療程內若血小板計數>100×109/L或血小板計數增幅≥50×109/L時停用；地塞米松(馬鞍山豐原藥業有限公司，國藥準字H20051748，生產批號191212-1)40 mg，靜脈滴注，每日一次，共4 d。對照組僅予大劑量地塞米松治療，用量用法同觀察組。2組病人治療過程中均不使用除研究藥物之外的其他治療ITP藥物。對于合并口腔、鼻腔或內臟等部位嚴重活動性出血的病人，酌情給予血小板輸注治療。

1.3 標本檢測 2組病人治療前后均抽取外周靜脈血，送至北京海思特醫學檢驗公司應用流式細胞術檢測病人CD4+CD25+FOXP3+Treg、Th1、Th2表達水平及Th1/Th2比值。

1.3.1 試劑及儀器 抗體：CD4(FITC)、CD25(APC)、Foxp3(PE)、IFN-γ(FITC)、IL-4(PE)均購自Becton Dickison公司；RPM 1640培養基(不含小牛血清)購自Becton Dickison公司；Perfix-nc破膜試劑盒(PerFix-ncbuffer1 fixative reagent，buffer2 permeabilizing reagent，buffer3 final 10×solution PBS)購自Life Technologies公司。實驗使用儀器：FACSCantoⅡ流式細胞儀(Becton Dickison公司)。

1.3.2 Treg細胞檢測 將CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-APC抗體各5 μL加入流式管中，并做同型對照管，對照管加相應的IgG1抗體；按照(1～10)×106/mL，取70 μL外周血樣本加入管中，震蕩、混勻，室溫避光孵育20 min；加1～3 mL 10×裂解液，震蕩混勻，避光裂解10 min、離心轉速1 500 r/min，離心5 min，棄上清；向管中加入固定液，震蕩混勻，放置于4 ℃冰箱，30 min固定，拿出后向該管中加入緩沖液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，重復1次，震蕩，混勻，室溫避光孵育20 min后，加入緩沖液，1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入3～5滴磷酸緩沖鹽溶液(PBS液)重懸，上機；利用流式細胞儀進行檢測，采用BD Cell Quest軟件分析實驗數據，FSC-SSC散點圖圈定淋巴細胞群，CD4-FITC/SSC圈定CD4+淋巴細胞，再從CD4+看CD25/Foxp3散點圖，即得到CD4+CD25+POXP3+Treg細胞占CD4+T細胞比例。

1.3.3 Th1、Th2細胞檢測 將100 μL全血與100 μL RPM1640培養基混勻，加入2 μL刺激劑，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養4～6 h；按照(1～10)×106/mL，取70 μL外周血樣本加入管中，震蕩、混勻，室溫避光孵育20 min；加1～3 mL 10×裂解液，震蕩混勻，避光裂解10 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清；向管中加入固定液，震蕩混勻，放置于4 ℃冰箱，30 min固定，拿出后向該管中加入緩沖液，離心轉速1 500 r/min，離心5 min，棄上清，重復1次；加入10 μL IFN-γ-FITC和10 μL IL-4 PE抗體，同時做同型對照管，對照管加相應的IgG1抗體，震蕩，混勻，室溫避光孵育20 min后，加入緩沖液，離心轉速1 500 r/min，離心5 min，棄上清。加入3～5滴PBS液重懸，上機；利用流式細胞儀進行檢測，采用BD Cell Quest 軟件分析實驗數據，FSC-SSC散點圖圈定淋巴細胞群，采用CD4+IFN-γ+IL-4-細胞評價Th1細胞水平，用CD4+IL-4+IFN-γ-細胞評價Th2細胞水平。

1.4 療效評價及不良反應觀察 根據血小板水平判斷療效：(1)完全反應，治療后血小板計數≥100×109/L且無出血；(2)有效，治療后血小板計數≥30×109/L并且至少比基礎血小板計數增加2倍且沒有出血；(3)無效，治療后血小板計數<30×109/L或者血小板計數增加不到基礎值的2倍或者有出血[6]。總有效率=(完全反應例數+有效例數)/病人總例數×100%。治療期間觀察并記錄2組病人藥物不良反應發生情況。

1.5 統計學方法 采用t(或t′)檢驗和秩和檢驗。

2 結果

2.1 2組病人臨床療效比較 觀察組治療總有效率為90.48%，高于對照組的67.50%(P<0.05)(見表1)。

表1 2組病人療效比較[ n；百分率(%)]

2.2 2組病人治療前后Treg細胞和Th1、Th2細胞表達水平及Th1/Th2比例比較 治療前，2組各項指標比較差異均無統計學意義(P>0.05)。治療后，2組Treg細胞及Th2細胞均較治療前明顯上調(P<0.01)，Th1細胞、Th1/Th2比例均較治療前明顯下降(P<0.01)，且觀察組Treg細胞及Th2細胞均明顯高于對照組，Th1細胞、Th1/Th2均明顯低于對照組(P<0.01)(見表2)。

表2 2組病人治療前后Treg、Th1、Th2細胞水平及Th1/Th2比例比較

2.3 2組藥物不良反應比較 治療期間，對照組病人出現血糖升高4例，高血壓2例，不良反應發生率為15.00%(6/40)；觀察組病人出現血糖升高3例，低鉀血癥2例，不良反應發生率為11.90%(5/42)，2組不良反應發生率差異無統計學意義(χ2=5.72，P>0.05)。

3 討論

ITP是一種臨床常見的自身免疫性出血性疾病，其最經典的免疫機制是由體內抗原特異性自身抗體介導的血小板被單核-巨噬細胞過度破壞，引起發病。但仍有較多ITP病人的自身抗體檢測為陰性，提示還有其他因素參與免疫發病。目前ITP的治療首選仍是糖皮質激素，但仍有部分重癥病人單獨使用糖皮質激素治療后效果不佳，而rhTPO治療此類病人療效明顯、安全性好，在臨床上應用越來越多。TPO是機體內誘導巨核細胞增殖分化、促血小板生成的重要調控因子，能促進巨核細胞膜成熟及血小板釋放。ITP病人由于血小板破壞增多，使體內TPO的清除加速，但內源性的TPO未明顯增加，故其血漿中TPO水平不增高或輕度增高[7]，而內源性TPO產生相對不足也是ITP病人血小板生成障礙的重要原因之一[8]，為TPO受體激動劑治療ITP提供了理論依據。

T淋巴細胞的表達異常及功能紊亂是ITP病人發病的重要免疫機制。Th根據分化方向不同，可分為Th1、Th2、Th17、Treg等，在機體免疫系統中起重要作用，Th細胞的比例異常及功能改變可密切參與ITP的發病過程。Treg細胞是一類具有獨特免疫調節作用的Th細胞，可參與機體誘導和維持自身免疫耐受，在免疫相關性疾病中發揮重要作用[9]。Treg細胞可高表達CD25，并分泌白細胞介素(IL)-10及轉化生長因子β(TGF-β)等多種細胞因子，表達特異性轉錄因子FoxP3，因此CD4+CD25+Foxp3+是最經典的Treg細胞免疫表型。研究表明，ITP病人外周血、脾臟及骨髓中的Treg細胞數量均明顯下降[10-12]，且有Treg細胞miRNAs的低表達[13]，引起增殖相關蛋白水平下降和細胞自噬功能降低從而參與疾病的發生發展[14-15]。研究[10]發現，在經TPO受體激動劑方案治療后，ITP病人Treg細胞失調得到改善，血小板計數恢復。本研究發現，ITP病人單用地塞米松其Treg細胞數量即可增加，但聯合rhTPO后病人Treg細胞增加更為明顯，療效更優，可以效升高血小板，未見嚴重不良反應，耐受性好。姜明敏等[16]發現rhTPO能顯著增加ITP小鼠脾臟中的Treg細胞數量，升高血小板。而在孕期ITP的研究[17-18]中發現，rhTPO能明顯升高Treg細胞及TGF-β1，迅速恢復血小板，安全性高，是治療ITP孕婦的安全有效選擇。還有研究表明[5,19]，rhTPO能顯著增加ITP病人Treg細胞的抑制功能，控制疾病發展。后期可進一步研究rhTPO對Treg細胞功能的調節作用。

Th1和Th2細胞是由Th0細胞直接分化而來，Th1細胞可分泌IFN-γ、TNF、IL-2等細胞因子，發揮細胞免疫效應；Th2細胞可分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細胞因子，可促進B細胞活化，產生漿細胞及自身抗體，發揮體液免疫的作用。生理狀態下，Th1和Th2細胞的分泌維持動態平衡，共同維護機體免疫內環境的穩定。研究[20-21]發現，ITP病人存在Th1/Th2平衡偏移，即Th1細胞占數量優勢，介導了一系列免疫反應引起免疫調節功能紊亂，導致ITP發病。經有效治療病情緩解后Th1和Th2細胞則逐漸恢復正常，Th1/Th2平衡恢復[22-23]。有研究[24-25]發現，TPO受體激動劑可降低再生障礙性貧血病人體內的Th1細胞水平，起到調節免疫、促進造血作用。而rhTPO可通過調節ITP病人的Th1、Th2免疫平衡而發揮治療作用[26]。本研究結果顯示，ITP病人外周血中Th1細胞水平升高，Th2細胞水平降低，Th1/Th2比例升高，存在Th1細胞免疫偏移，發生Th1/Th2比例失衡，地塞米松單藥治療后病人Th1細胞比例下降，Th2細胞比例升高，Th1/Th2失衡狀態得到一定改善，而聯合應用rhTPO治療后，Th1細胞進一步下降，Th2細胞進一步升高，Th1/Th2失衡狀態明顯改善，療效明顯提高。rhTPO對Th1、Th2細胞免疫功能的調節作用有待進一步研究。

綜上所述，原發性ITP病人應用rhTPO聯合大劑量地塞米松方案治療后能通過增加病人Treg細胞及Th2細胞數量、降低Th1細胞數量，糾正Th1/Th2細胞平衡紊亂，安全有效升高血小板，提高臨床治療效果。