miR-34a表達調(diào)控紊亂與抑郁障礙和抗抑郁療效的關(guān)聯(lián)研究☆

王俊彥 張興磊 王紀智 張愛霞 楊春霞 劉志芬△ 張克讓 孫寧△

在抑郁障礙病因?qū)W研究中，表觀遺傳是重要調(diào)控機制。 其中，微小 RNA（microRNA，miRNA）調(diào)控是重要環(huán)節(jié)之一。研究顯示，miRNAs表達水平與抑郁障礙發(fā)病可能相關(guān)[1-4]。抗抑郁治療可改變miRNAs及其下游靶點的表達[5-6]。因此，miRNAs不僅在抑郁障礙發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且可能為開發(fā)抑郁障礙治療靶點提供新的途徑[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-34b-5p、miR-34c-5p在抑郁障礙患者外周血中明顯升高，且與抑郁嚴重程度呈正相關(guān)[8]。動物研究發(fā)現(xiàn)應激模型大鼠血漿miR-34a表達增強，而氟西汀可降低miR-34a表達水平[9]。以上研究結(jié)果提示miR-34a可能是影響抑郁障礙的關(guān)鍵miRNA。本研究通過比較抑郁障礙患者和正常對照外周血miR-34a的表達情況，及抗抑郁藥物對miR-34a表達的影響，試圖尋找相關(guān)的生物學標志，并為個體化抗抑郁治療提供生物學預測指標。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2013年5月至2017年10月山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院精神衛(wèi)生科門診、住院首發(fā)未用藥抑郁障礙患者。納入標準：①漢族，年齡18～60歲；②符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版 》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，F(xiàn)ourth Edition，DSM-IV）抑郁障礙診斷標準，經(jīng)過2名精神科主治以上職稱醫(yī)師用中文版DSM-IV-TR軸I障礙用臨床定式檢查（SCIDI/P）為篩查工具一致診斷；③17項漢密爾頓抑郁量 表 （Hamilton depression scale，HAMD-17） 總分≥17分；④首次發(fā)病，未曾接受過精神科藥物治療、電休克或心理治療。排除標準：①有嚴重自殺傾向或其他精神障礙病史；②存在酒精或其他精神活性物質(zhì)依賴或濫用；③存在嚴重心腦血管疾病或其他軀體疾病；④妊娠或哺乳期女性。納入100例首發(fā)未用藥抑郁障礙患者，其中18例在隨訪過程中無法配合，予以剔除，最后82例抑郁障礙患者納入分析。

對照組為山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院精神衛(wèi)生科招募的健康志愿者。納入標準：①漢族，年齡18～60歲；②HAMD-17總分<7分；③無抑郁障礙發(fā)作史；④無精神疾病及精神疾病家族史；⑤入組前的1個月內(nèi)未服用任何藥物。排除標準：①存在酒精或其他精神活性物質(zhì)依賴或濫用；②存在嚴重心腦血管疾病或其他軀體疾病；③妊娠或哺乳期女性。最終納入60名健康志愿者。

本研究方案通過山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院倫理委員會審查批準。所有患者及其家屬和健康志愿者簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 量表評估 收集患者和對照年齡、性別、婚姻狀況、家族史、物質(zhì)濫用史等資料。治療前和治療8周末采用HAMD-17量表評估患者臨床癥狀和療效。根據(jù)治療8周末HAMD-17總分判斷患者是否臨床治愈（臨床治愈標準：HAMD-17總分≤7分），治療是否顯效（顯效標準：HAMD-17總分減分率≥50%）。

1.2.2 藥物治療 抑郁障礙患者使用5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs）類抗抑郁藥治療8周，主要藥物為艾司西酞普蘭（n=47）、舍曲林（n=23）和氟西汀（n=30）。從小劑量起始，根據(jù)個體臨床癥狀逐步增加劑量，于4周末加到最大治療劑量。研究期間睡眠障礙者可短期合用苯二氮艸卓類藥物。

1.2.3 miR-34a表達檢測 所有被試抽取4 mL空腹靜脈血，于3500 rpm離心10 min，吸取血漿保存于-80℃冰箱。采用Trizol試劑提取外周血miRNA，分光光度計檢測RNA的濃度和純度。將提取的miRNA使用miRcDNA合成試劑，在42℃60 min、95℃ 5 min反應條件下反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照qRT-PCR反應試劑盒進行PCR反應。采用2-ΔΔCT法計算目標基因miR-34a相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0進行分析。年齡以均數(shù)±標準差（±s）描述，組間比較使用獨立樣本t檢驗。miR-34a表達水平采用中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）[M（QL，QU）]描述，患者組和對照組、治愈組和非治愈組、顯效組和非顯效組比較采用Mann-Whitney U檢驗，治療前后比較用配對樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗。采用Spearman相關(guān)分析miR-34a表達水平和抑郁嚴重程度的關(guān)系。構(gòu)建受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）分析miR-34a對抑郁障礙診斷的效能。檢驗水準α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 一般人口學資料 患者共82例，男24例，女58例，年齡（34.78±10.96）歲。對照共 60名，男 20名，女 40 名，年齡（32.03±10.23）歲。 兩組的年齡（t=-1.517，P=0.132）、 性別（=0.268，P=0.605）差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 miR-34a表達水平 患者組miR-34a表達水 平為 9.12（3.85，51.34），對照組為 1.49（0.42，3.43），患者組高于對照組（Z=-7.099，P=0.001）。

2.3 患者治療前后miR-34a表達水平 患者治療后 miR-34a 表達水平為 8.98（2.88，28.66），較治療前降低（Z=-2.140，P=0.032），但仍高于對照組（Z=-6.125，P=0.001）。

2.4 治愈組與未愈組、顯效組與非顯效組治療前后的miR-34a表達水平 治愈組和未愈組的miR-34a表達水平治療前差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.939，P=0.335）， 治療 8周后 miR-34a表達水平組間差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.048，P=0.962）。見表1。顯效組和非顯效組的miR-34a表達水平治療前差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.356，P=0.175），治療8周后miR-34a表達水平組間差異無統(tǒng)計學意義（Z=0.560，P=0.576）。 見表 2。

表1 治愈組與未愈組患者HAMD-17總分與miR-34a表達水平

表2 治療顯效組與治療非顯效組患者HAMD-17總分與miR-34a表達水平

2.5 miR-34a表達與抑郁障礙嚴重程度的關(guān)系相關(guān)性分析顯示，所有患者治療前miR-34a表達水平與HAMD-17評分相關(guān)性無統(tǒng)計學意義（r=0.043，P=0.701）。

2.6 miR-34a表達水平診斷抑郁障礙的ROC曲線 抑郁障礙外周血miR-34a表達水平區(qū)分抑郁障礙與對照的曲線下面積AUC=0.849（P<0.001，95%CI：0.787～0.911）， 當外周血 miR-34a 為 3.586（2-ΔΔCT值）時，約登指數(shù)為最大值0.618，此時的敏感度為76.8%，特異度為85.0%。見圖1。

圖1 外周血miR-34a對抑郁障礙診斷效能 以miR-34a值為檢驗變量，患者和對照分組為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線，AUC=0.849（95%CI：0.787～0.911）。

3 討論

抑郁障礙是一種病因不明的精神疾病，目前仍缺乏客觀的診斷工具，且治療效果有限。找出抑郁障礙特異性的生物學標志物是目前臨床上重要任務。這對提高抑郁障礙的診斷效率，開展抑郁障礙的精準治療具有重要意義。大量證據(jù)表明遺傳因素是抑郁障礙關(guān)鍵的發(fā)病因素，表觀遺傳學的發(fā)展為探明抑郁障礙的遺傳機制提供了支持。miRNA作為重要的表觀遺傳機制之一，其表達譜已用于疾病診斷和新藥的開發(fā)。在眾多miRNA中，有研究表明miR-34a可能與抑郁障礙的發(fā)生有關(guān)。AZEVEDO等[10]發(fā)現(xiàn)miR-34a是在抑郁障礙、雙相障礙和精神分裂癥患者中均差異表達的miRNA，并在15例抑郁障礙患者和14名健康對照中發(fā)現(xiàn)，抑郁障礙患者死后腦組織前扣帶回miR-34a表達水平明顯下降。而本研究發(fā)現(xiàn)抑郁障礙患者外周血miR-34a的表達水平顯著高于正常對照。這一研究結(jié)論與AZEVEDO等[10]基于前扣帶回的研究結(jié)果不一致。出現(xiàn)結(jié)果不一致可能是由于檢測方法不同，本研究檢測的miR-34a是從 5'端的臂加工而來，與 AZEVEDO等[10]檢測的miR-34a在基因結(jié)構(gòu)上有差別。研究結(jié)果不一致也有可能是由于選取的組織差異造成。BAVAMIAN等[11]報道m(xù)iR-34a在小腦表達上調(diào)。由此推測，miRNA表達具有組織特異性效應，未來需要加大樣本量，進一步研究。在上述研究基礎上，本研究以miR-34a表達水平為檢驗變量建構(gòu)ROC曲線，結(jié)果顯示miR-34a表達水平對診斷抑郁障礙有一定的價值。 miR-34a 為 3.586（2-ΔΔCT值）時，約登指數(shù)最大值為0.618，此時的敏感度和特異度分別為76.8%和85.0%。表明miR-34a表達具有對抑郁障礙的診斷價值。

本研究對82例抑郁障礙患者抗抑郁治療前后miR-34a的表達水平變化進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-34a治療后表達水平降低。LOPEZ等[12]選取124例抑郁障礙患者進行為期8周的度洛西汀抗抑郁治療，對治療前后外周血miRNA進行小RNA測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個miRNA表達上調(diào)，7個miRNA表達下調(diào)。ZHOU等[13]用心境穩(wěn)定劑對原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元進行干預，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠海馬miR-34a表達水平下降。這些研究表明，抗抑郁藥物可能通過降低患者外周血miR-34a表達水平而發(fā)揮治療作用。此外，本研究根據(jù)患者治療后HAMD總分來判斷患者的療效，對不同臨床結(jié)局患者的miR-34a表達水平進行分析，結(jié)果顯示治愈組與未愈組、顯效組與非顯效組間的miR-34a表達水平均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明 miR-34a表達水平不能預測患者接受抗抑郁治療后是否能治愈以及是否顯效，miR-34a表達水平與抑郁障礙療效尚未證明有關(guān)。

本研究樣本量仍然偏小，對臨床的診療建議仍顯不足。未來需在長期追蹤的更大樣本中驗證。此外，本研究僅從臨床角度驗證了外周血miR-34a對抑郁障礙的影響，未來還需要開展細胞、動物等多層面的基礎實驗研究，進一步明確miR-34a影響抑郁障礙的機制。