脊髓小腦性共濟失調(diào)1型一哈薩克族家系遺傳學特征分析☆

馬建華 雷晶 張艷

脊髓小腦性共濟失調(diào)1型（spinocerebellar ataxia type 1，SCA1）是一種常染色體顯性遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，通常在30～40歲發(fā)病。SCA1最主要的病理表現(xiàn)是小腦萎縮，膠質(zhì)細胞增生和浦肯野細胞嚴重丟失，伴隨著橄欖核、齒狀核和腦干第 III、IV、IX、X、XII對腦神經(jīng)核退行性病變[1]。臨床早期表現(xiàn)為進行性小腦性共濟失調(diào)、構(gòu)音障礙，吞咽困難，腱反射活躍、眼球震顫、掃視過度[2-3]，伴隨病程進展出現(xiàn)眼球掃視減慢、上視麻痹、肌張力減低、辨距不良等[4]，疾病晚期由于延髓功能障礙導致呼吸衰竭是患者的主要死因[2-3，5]。國內(nèi)目前報告SCA1家系均為漢族人群。本研究對新疆地區(qū)一哈薩克族家系SCA1患者、家系中健康人員和正常對照者進行ATXN1基因CAG三核苷酸重復拷貝數(shù)研究，旨在了解哈薩克族SCA1患者及正常人群基因分布特征，為該病的治療研究提供方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究先證者為 2011年10月就診于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科臨床初步診斷為脊髓小腦性共濟失調(diào)（SCA）的哈薩克族患者，經(jīng)家系調(diào)查繪制系譜圖（見圖 1）。該家系均為哈薩克族人，非近親結(jié)婚。SCA患者臨床診斷依據(jù) Harding標準[6]。正常對照者為在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診收集的正常哈薩克族健康對照者60名，均無血緣關(guān)系且排除神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病及家族史。

1.2 臨床資料分析 由2位神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師對先證者及部分家庭成員進行詳細的病史詢問和神經(jīng)系統(tǒng)專科檢查，并詳細記錄檢查結(jié)果。

1.3 基因型檢測 ①DNA提取：經(jīng)所有受試者知情同意后，采集該家系臨床疑診 SCAs的42例（9例患者、33例家系“健康”成員）及60名正常對照者的靜脈血5 mL于EDTA抗凝管中。按天根基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作。紫外分光光度計A260/A280定量，分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩＂诨蛐秃Y查：參考相關(guān)文獻進行引物序列[7]的設(shè)計，并由由上海生工生物工程股份有限公司合成，包括SCA1-A 5'-AACTGGAAATGTGGACGTA-3'、SCA1-B 5'-CAACATGGGCAGTCTGAG-3'，SCA2-A 5'-GCGTGCGAGCCGGTGTAT-3'、SCA2-B 5'-GGACGAGGACGGCGAAGG-3'，SCA3-A 5'-CCA GTGACTACTTTGATTCG-3'、SCA3-B 5'-CTTACCT ACATCACTCCCA-3'，SCA7-A 5'-TGTTACATTGT AGGAGCGGAA-3'、SCA7-B 5'-CACGACTGTCC CAGCATCACTT-3'和SCA12-A 5'-TGCTGGGAA AGAGTCGTG-3'、SCA12-B 5'-GCCAGCGCACTC ACCCTC-3'共5對引物，行聚合酶鏈反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳篩查相應(yīng)的基因型。③目的基因的擴增和DNA重組：將篩查出的SCA1目的片段切膠回收純化，將切膠回收DNA產(chǎn)物做為DNA模板，再次行聚合酶鏈反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳驗證，并與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，對感受態(tài)細胞進行培養(yǎng)，取陽性克隆搖菌，抽提質(zhì)粒，ABI377型全自動 DNA測序儀自動讀取數(shù)據(jù)。本研究中正常對照者及家系中正常者均為純合子，可將PCR擴增產(chǎn)物直接測序。

2 結(jié)果

2.1 SCA1患者臨床資料分析 該家系5代共 108人。發(fā)病13例，現(xiàn)存患者9例，發(fā)病年齡29～56歲，平均 （42.58±8.67）歲，病程7～25年，平均（14.67±5.80）年，家系譜符合常染色體顯性遺傳模式（圖1）。臨床主要以行走不穩(wěn)、構(gòu)音障礙為突出癥狀。其他較常見的癥狀主要包括雙眼水平性眼球震顫、吞咽困難、飲水嗆咳、下肢痛性痙攣、聲音嘶啞和認知功能障礙。

圖1 哈薩克族SCA1家系圖

2.2 SCA1基因CAG重復序列檢測結(jié)果 42例家系成員中SCA1基因突變者19例，已發(fā)病患者9例，尚未發(fā)病但基因檢測異常者10例，均是雜合子。5例已發(fā)病患者和4例尚未發(fā)病但基因檢測異常者（見圖2），共9例經(jīng)重組DNA技術(shù)成功（見圖3）。5例已發(fā)病患者ATXN1異常等位基因CAG 重復數(shù)目為 41～47 次，平均（44.00±2.23）次，中間無CAT插入；正常等位基因CAG重復數(shù)目是 24～27 次，平均（26.20±1.30）次，均有 2 次 CAT插入；4例癥狀前患者ATXN1異常等位基因CAG重復數(shù)目為 40～43 次，平均（41.75±1.26）次，中間無CAT插入；正常等位基因CAG重復數(shù)目分別是 26～29 次，平均（27.50±1.73）次，均有 2 次 CAT插入（見表 1）。

表1 哈薩克族SCA1家系患者CAG重復次數(shù)與CAT插入次數(shù)統(tǒng)計

圖2 SCA1家系患者PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳圖 M為marker。

圖3 分子克隆后產(chǎn)物鑒定：菌液PCR M為marker。

家系中正常成員共 23名，男10名，女13名，均為純合子。CAG重復次數(shù)范圍在17～30次，平均 （25.26±2.90） 次，28次為最常見頻率，占21.74%；CAT 插入次數(shù) 0～4 次，平均（2.00±1.30）次，2次為最常見頻率，占 30.43%（見圖 5）。（CAG）nCATCAGCAT（CAG）n 形式出現(xiàn)頻率最高，占30.43%。

圖4 III:22異常基因測序結(jié)果 CAG重復45次，無CAT插入。

圖5 SCA1家系正常成員基因測序結(jié)果 CAG重復24次；有2次CAT插入。

健康對照者共60名，均為哈薩克族。男25名，女 35名，年齡 14～81歲，平均年齡（46.50±15.31）歲。經(jīng)檢測均為純合子。CAG重復次數(shù)12～30 次，平均（25.87±2.61）次，27 次頻率最高占 30%；CAT 插入次數(shù) 0～5次，平均（2.10±1.29）次， 2次為最常見頻率，占 40.00%（見圖 6），以（CAG）nCATCAGCAT（CAG）n形式出現(xiàn)頻率最高，占40.00%。

圖6 SCA1家系正常成員基因測序結(jié)果 CAG重復25次；有2次CAT插入。

3 討論

SCA1是由位于6p22.3的ATXN1基因第8外顯子的CAG三核苷酸序列異常重復擴增，導致其編碼的ataxin-1蛋白發(fā)生突變。突變的 ataxin-1蛋白主要在Purkinje細胞內(nèi)形成核內(nèi)包涵體（INIs），核內(nèi)包涵體的聚集影響部分細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和降解，導致 Purkinje細胞進行性變性[8]。正常等位基因中CAG重復6～35次[9-11]，當 CAG連續(xù)重復≥39次時，重復次數(shù)的大小和發(fā)病年齡之間呈負相關(guān)。

共濟失調(diào)是本研究SCA1患者最常見的臨床表現(xiàn)，這符合SCA1在宏觀上以脊髓-小腦萎縮為主的病理特征。患者均以步態(tài)共濟失調(diào)為首發(fā)癥狀，這與小腦半球病變導致同側(cè)肢體共濟失調(diào)相一致，而絨球小結(jié)節(jié)葉和后蚓部的病變通常導致軀干共濟失調(diào)相一致。

III:12是本研究先證者，40歲發(fā)病，主要表現(xiàn)為言語不清，行走不穩(wěn)等小腦共濟失調(diào)癥狀，其異常等位基因CAG連續(xù)重復45次。III:9、III:20、III:22分別是先證者大哥和堂哥，其異常等位基因CAG連續(xù)重復次數(shù)分別為43、44和47次，III:22 CAG異常重復次數(shù)雖然大于III:12，但以上三者發(fā)病年齡均晚于先證者，鑒于III:12與III:22屬旁系而非直系關(guān)系，可能與其父系異常等位基因數(shù)有關(guān)，但其父輩均去世，無法進行驗證。III:14是本研究基因重組成功的發(fā)病者中唯一一位女性患者，35歲發(fā)病，其異常等位基因CAG連續(xù)重復41次小于先證者，但其發(fā)病年齡卻早于先證者，有報告稱只有36%～70%的發(fā)病年齡差異可以通過CAG重復數(shù)目的大小來解釋[5]，可能存在其他因素影響ATXN1基因產(chǎn)物的表達。本研究中已發(fā)病者CAG連續(xù)重復次數(shù)平均（44.00±2.23）次，與國內(nèi)韓燕等[12]報告的SCA1家系患者CAG連續(xù)重復次數(shù)54～68次、唐北沙等[13]報告漢族SCA1先證者及散發(fā)者CAG病理重復次數(shù)范圍在39～60次，以及國外報道的CAG重復次數(shù)范圍39到>100次[14]相比，哈薩克族人群CAG異常重復次數(shù)處于異常值低限。4例癥狀前患者異常等位基因CAG重復數(shù)目為 40～43 次，平均（41.75±1.26）次，因目前尚無臨床癥狀，不能診斷為SCA1，需動態(tài)隨訪觀察。

國內(nèi)姜淼等[15]對東北地區(qū)110名漢族正常個體SCA1基因CAG三核苷酸重復序列進行檢測，發(fā)現(xiàn)等位基因雜合頻率84.55%，CAG重復次數(shù)在20～39之間，26是最常見重復次數(shù)。唐北沙等[16]對300名中國漢族人群SCA內(nèi)CAG三核苷酸重復序列進行測定，發(fā)現(xiàn)等位基因雜合頻率為75%，CAG 重復次數(shù)在 17～35 次，平均（28.32±2.03）次，28次是最常見重復次數(shù)。本研究SCA1正常對照者為哈薩克族人群，均為純合子，CAG重復次數(shù)12～30 次，平均（25.87±2.61）次，27 次頻率最高。與前兩者比，正常哈薩克族人群CAG重復次數(shù)較漢族人群相對偏低，考慮可能與民族差異性存在一定關(guān)系。

本研究在進行基因測序時發(fā)現(xiàn)正常哈薩克族人群和SCA1患者正常等位基因中存在CAT插入現(xiàn)象，國內(nèi)對相關(guān)報告較少。查閱文獻后發(fā)現(xiàn)，早在1993年CHUNG等[17]在對126個正常的 SCA1染色體分析中發(fā)現(xiàn)98%未擴增的等位基因有一個插入的重復結(jié)構(gòu)CAT，而擴增的30個等位基因中沒有該結(jié)構(gòu)的插入。CHUNG等[17]推斷SCA1等位基因的擴增可能與CAT插入片段的缺失有關(guān)。QUAN等[18]和 FRONTALI等[19]研究發(fā)現(xiàn) CAT在CAG擴增等位基因的插入可以延遲發(fā)病年齡，甚至完全消除發(fā)病，并由此得出在SCA1等位基因中CAT三核苷酸的插入，抑制了DNA中二級結(jié)構(gòu)滑鏈結(jié)構(gòu)的形成，防止復制過程中DNA的重復擴增，防止蛋白質(zhì)錯誤折疊，提高基因穩(wěn)定性[20]。這一結(jié)論可以解釋本研究結(jié)果中在正常等位基因中發(fā)現(xiàn)CAT結(jié)構(gòu)插入這一現(xiàn)象。歐洲一項關(guān)于SCA1的研究也發(fā)現(xiàn)ATXN1基因上擴增的和正常的序列均對于預(yù)測發(fā)病年齡起到很大的作用[21]，SCA1患者的發(fā)病年齡受ATXN1擴增鏈和正常鏈共同影響 ，而且正常鏈發(fā)揮積極的影響 ，這一發(fā)現(xiàn)與上述結(jié)論不謀而合。所以SCA 1的發(fā)病年齡不是由CAG重復的總數(shù)決定的，而是由CAG連續(xù)重復總數(shù)決定[22]。CAG連續(xù)重復長度決定了共濟失調(diào)的嚴重程度，并且是較好的發(fā)病年齡預(yù)測因子。

關(guān)于SCA異常等位基因在父系和母系傳遞過程中變化的問題。ORR等[5]和CHUNG等[17]發(fā)現(xiàn)63%的父系傳遞導致CAG重復序列平均擴增+3.3重復，69%的母系傳遞導致CAG重復序列沒有改變或減少；平均而言，母系傳遞導致重復序列減少-0.4重復。JODICE等[23]發(fā)現(xiàn)父系傳遞導致CAG重復序列增加1.75個，母系的傳遞導致CAG重復序列減少-0.5個。RANUM等[24]在對SCA1減數(shù)分裂不穩(wěn)定性的研究中得出男性傳播占82%，女性占60%。因此CAG不穩(wěn)定擴增具有性別差異，更容易發(fā)生在父系遺傳中。這與精子中的SCA1等位基因更不穩(wěn)定有關(guān)，代際間重復擴增可發(fā)生于精子細胞前體分裂、精子細胞成熟、減數(shù)分裂、減數(shù)分裂后成熟和早期胚胎發(fā)育中任何一個時期[25]。本研究結(jié)果雖然可見代際間存在CAG重復次數(shù)波動（III:9、IV:1和V:8是一完整家系，異常CAG重復次數(shù)分別為43、43和42次），但沒有明顯的差異，并且由于本研究未能將患者及癥狀前患者異常等位基因內(nèi)CAG重復次數(shù)完全檢測出來，無法進行父系及母系遺傳結(jié)果的統(tǒng)計學分析對比，但根據(jù)大量研究數(shù)據(jù)結(jié)果看來，仍支持上述觀點。

哈薩克族SCA1家系是國內(nèi)首次報告少數(shù)民族家系，與漢族人群相比，其異常等位基因及正常等位基因重復次數(shù)均略低，可能與該病存在種族差異性有關(guān)。等位基因中CAT結(jié)構(gòu)的插入更有利于基因的穩(wěn)定性，可能對該病治療的研究提供幫助。